内容提要
本研究设计并合成一种能被一氧化氮有效活化的D-p-A-p-D有机小分子CTBA。CTBA在可见光区有吸收和发射。在与肿瘤微环境中过量的一氧化氮反应后，探针可以转化为具有新结构的CTBT，该探针在808 nm激发下具有优异的NIR-II荧光和光动力和光热性能。这种可激活探针率先融合了三个关键特征:(1)NIR-II深层组织可视化成像能力，(2)按需治疗激活，(3)协同光动力-光热效应。凭借其“开启”的特性，该探针显著降低了成像的背景噪声和光疗过程中对正常组织的损伤。然后，在CTBA和PS1000–PEG2000之间自组装构建CTBA- nps，在体外和体内均可实现高精度、高效的肿瘤诊断和治疗。
结果与讨论
CTBA的设计、合成及其对一氧化氮的响应特性
苯并[c]噻二唑-5,6-二胺因能与一氧化氮快速反应生成三唑衍生物而广泛应用于一氧化氮检测。为了获得具有NIR-II发射的荧光团，我们将其作为电子受体与电子给体环五[2,1-b:3,4-b0]二噻吩(CPDT)和噻吩偶联，形成D-p-A-p-D型有机荧光团CTBA。作为电子供体，当CPDT与合适的电子受体结合时，探头可以在激光激发下实现光动力或光热效应。CPDT的大电子密度也可以保证荧光团在近红外II区发射。同时，引入的富电子噻吩单元起到了p间隔层的作用，增加了电子离域。通过核磁共振(NMR)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)成功地对所设计的CTBA和中间体进行了受体与一氧化氮反应后，CTBA可以转化为具有新结构的CTBT，从而引起光物理性质的变化。CTBA的吸收范围在300 nm到550 nm之间，峰值在385 nm左右。发射光谱范围从450nm到750nm，最大发射波长为560nm。当苯并[c]噻二唑-5,6-二胺被一氧化氮氧化形成更强的受体5H-[1,2,3]三唑[4,5-f]-2,1,3-苯并-噻二唑时，有利于分子内电荷转移(ICT)过程，从而减小了整个荧光的带隙，实现了波长的显著红移。因此，当CTBA溶液中加入NO时，吸收光谱在600-900 nm处出现了较大的红移。同时，其发射光谱向800 ~ 1200 nm的NIR-II窗口移动，并伴有较强的NIR-II荧光。采用MALDI-TOF-MS验证CTBA与NO反应后产物的生成。当CTBA与NO混合时，在~ 1143处观察到属于三唑衍生物CTBT的质谱峰谱性质的变化表明，CTBA可以作为一种理想的NIR-II荧光探针用于检测NO。
CTBA-NPs的制备、光物理性质及对一氧化氮的响应
采用纳米共沉淀法构建了CTBA-NPs 用PS1000–PEG2000封装CTBA的CTBA-NPs。随后，研究了CTBA-NPs的光物理性质。CTBA-NPs的光谱与CTBA相似，吸光度为300 nm ~ 550 nm，发射光谱为500 nm ~ 750 nm。CTBA-NPs的水合粒径为~ 96 nm。扫描电镜(SEM)图像显示，CTBA-NPs的形貌呈球形，均匀。CTBA-NPs在水中保存30天后，其粒径、吸收光谱和荧光光谱均无明显变化，证明其具有良好的胶体稳定性。此外，还对CTBA-NPs在生物条件下的稳定性进行了评价。光谱性质和粒径在7天内均未发生明显变化，证实了其优异的系统稳定性。其次，研究了CTBA-NPs对NO的光学性质。在不添加NO的情况下，在695 nm处没有观察到吸收峰。但在加入NO后，这里出现了吸收峰，并随着NO浓度的增加而持续增加，在0-25 mM浓度范围内与NO浓度呈良好的线性关系†)。相应的，CTBA-NPs在925 nm处的发射强度也随着NO浓度的增加而增加，呈现出很好的线性关系。同样，随着NO浓度的增加，NIR-II荧光成像信号强度也逐渐增大。NO加入后CTBA-NPs的吸收光谱和NIR-II荧光信号的变化是由于NO将邻苯二胺受体基团氧化为更强的受体，增强了整个分子的ICT过程。此外，为了探究CTBA-NPs与NO反应的持续时间，在CTBA-NPs溶液中加入过量的NO，并在不同时间测量其吸收和发射光谱。随着时间的延长，CTBA-NPs在695 nm处的吸光度和925 nm处的强度逐渐增加，并在4 h时达到平稳，证实CTBA-NPs在4 h内可以与外源NO完全反应。同时，还测试了不同pH条件下的响应率。CTBA-NPs在酸性条件下可以更快地活化。因此，肿瘤组织的酸性微环境更有利于这一激活过程的发生。为了测试CTBA-NPs对NO反应的特异性，CTBA-NPs用一组生物学相关分析物处理，如活性氧，活性氮物种、蛋白质和金属离子。仅在NO存在的情况下，695 nm处的吸收率明显增强，而与其他干扰物孵育后吸收率保持不变，说明CTBA-NPs对NO具有较高的选择性。
CTBA-NPs的光动力和光热性质
以2-0,70-二氯二氢荧光素(DCFH-DA)为指示剂，检测近红外光激发下产生的ROS。在ROS存在下，DCFH-DA被氧化为具有高荧光的2,7-二氯荧光素(DCF)。CTBA-NPs在808 nm激光照射下几乎不产生ROS，因为在没有一氧化氮的情况下，808 nm处的吸收可以忽略不计。然而，当与NO充分反应形成产物CTBT时，在浓度为2.5 mM时可以观察到大量ROS的生成，当浓度达到10 mM时，ROS的生成可达到空白的70倍左右。这表明CTBA-NPs在被一氧化氮激活时具有显著的光动力学效应。为确定ROS的类型，采用9,10-蒽二基-双(-亚甲基)双丙二酸(ABDA)、二氢霍达明123 (DHR123)和羟基苯基荧光素(HPF)分别检测1O2、cO2−andcOH。在6 min的辐照过程中，ABDA的吸光度几乎没有变化。这一结果表明1O2不是通过II型途径产生的。相比之下，在激光照射下，DHR123和HPF的荧光强度在6 min内显著增加，反映了通过I型途径产生cO2−andcOH的出色能力。此外，还对CTBA-NPs的光热性能进行了评价。在808 nm激光照射下，未被NO活化的CTBA-NPs没有明显的热效应。但经NO活化后，10 mM、25 mM和50 mM CTBA-NPs溶液的温度在10 min内分别升高12.2℃、17.4℃和22.1℃。研究了NO活化CTBA-NPs的光热转化效率。在808 nm激光照射下，CTBA-NPs的温度在10分钟内逐渐升高，然后逐渐自然恢复到室温。随后，拟合曲线和公式计算光热转换效率h为22.3%。光热稳定性是判断光热试剂是否适合进一步生物应用的重要依据。因此，我们测试了NO活化的CTBA-NPs的光热稳定性。在激光开关的5个周期中，溶液温度的上升和下降趋势并没有表现出明显的变化。上述结果表明，NO活化的CTBA-NPs具有良好的光热性能和显著的光热稳定性。简而言之，体外ROS生成和光热效应研究表明，CTBA-NPs在被NO激活之前几乎没有光疗作用。但经NO活化后，CTBA-NPs在808 nm激光照射下具有优异的光疗效果。因此，这样的“转向”策略使其在进一步应用于肿瘤治疗中具有更强的可控性。
CTBA-NPs的体外生物相容性及抗肿瘤效果
选择正常细胞HUVEC(人脐静脉内皮细胞)和癌细胞HepG2(人肝癌细胞)和H22(小鼠肝癌细胞)，用CTBA-NPs孵育后评估其细胞活力。不同浓度的CTBA-NPs (0-100 mM)处理后，三种细胞的存活率均在80%以上。这表明CTBA-NPs具有良好的体外生物相容性，可以进一步用于体内应用。接下来，评估CTBA-NPs在HepG2细胞中的细胞摄取性能。CTBA-NPs与HepG2细胞孵卵后，CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)可以清楚地观察到细胞摄取的时间依赖性。CTBA-NPs在8 h时可被HepG2细胞明显摄取，12 h时摄取完成，表明CTBA-NPs可被细胞很好地内化，为光疗的进一步探索提供了可能。由于CTBA-NPs可以被一氧化氮有效激活，因此我们在不同条件下评估了CTBA-NPs对不同癌细胞的毒性。当CTBN-NPs未被一氧化氮激活时，808 nm激光照射下HepG2和H22细胞的细胞活力仍可维持在80%以上。同样，当CTBN-NPs被一氧化氮激活而不被808 nm激光照射时，对两种细胞的毒性也很低。这表明CTBA-NPs在没有过量一氧化氮和激光照射的情况下不会引起细胞损伤，保证了其对正常组织的生物安全性。相反，当CTBA-NPs浓度为50 mM时，经过一氧化氮活化后，HepG2和H22的细胞存活率分别为~ 23%和~ 21%，这是因为当被一氧化氮活化时，CTBA-NPs在808 nm激光照射下表现出显著的光动力和光热效应。从而导致肿瘤细胞的损伤和凋亡。为了进一步证实这一结果，我们进行了钙黄蛋白乙酰氧基甲酯(calcein AM)/碘化丙啶(PI)双染色的荧光成像实验。在808 nm激光照射下，CTBA-NPs只有经过一氧化氮活化才能杀死肿瘤细胞，这与MTT染色结果一致。接下来，我们验证了活化的CTBA-NPs在HepG2细胞中产生ROS的能力。DCFH-DA检测不同处理后HepG2细胞的ROS水平。可以清楚地观察到添加一氧化氮和808 nm激光照射的组产生了明显的绿色荧光，证实激活的CTBA-NPs在光动力作用下可以杀死肿瘤细胞激光照射。
CTBA-NPs NIR-II窗口的体内肿瘤成像
由于穿透深层组织的特性对NIR-II成像至关重要，因此在将CTBA-NPs应用于体内成像之前，需要对其组织穿透能力进行评估。当CTBA-NPs与一氧化氮充分反应时，产生明亮的NIR-II荧光。在相同成像条件下，调节浓度时CTBA-NPs与ICG亮度一致。当组织厚度逐渐增加时，ICG信号强度明显降低，同时信号背景比(SBR)降低，半最大值全宽(FWHM)增大，成像分辨率明显降低。相比之下，当组织厚度小于4 mm时，CTBA-NPs的荧光信号仍能保持大于2的SBR。当组织厚度增加到6 mm时，还可以观察到属于CTBA-NPs的荧光信号。总体而言，CTBA-NPs用于NIR-II成像的SBR和FWHM优于ICG。所有结果表明，CTBA-NPs可用于理想的体内NIR-II成像。接下来，将CTBA-NPs应用于小鼠肿瘤的NIR-II成像。CTBA-NPs可以通过增强的渗透性和滞留性(EPR)效应在肿瘤部位富集，并被肿瘤微环境中过量的一氧化氮激活。在808 nm激光照射下，活化产物表现出明显的NIR-II荧光。在12 h时，肿瘤部位可以观察到明显的荧光发射。随着肿瘤中CTBA-NPs的富集，一氧化氮的活化增强，在72 h内荧光强度逐渐增强。值得注意的是，CTBA-NPs的NIR-II荧光被一氧化氮特异性激活，而成像过程中背景信号是不可观察到的。这表明氧化氮活化的纳米荧光CTBA-NPs可以实现肿瘤NIR-II的灵敏、精确成像。此外，当瘤内注射脂多糖(LPS)溶液刺激炎症并产生更多的一氧化氮时，荧光强度也显著增强，进一步证实CTBA-NPs的NIR-II荧光确实被一氧化氮激活。最后，处死小鼠，解剖进行NIR-II肿瘤成像，对其主要脏器和肿瘤进行离体NIR-II荧光成像。由于激活成像的特异性，在小鼠主要脏器中未观察到明显的NIR-II荧光信号。LPS刺激后，小鼠的胃和肠内出现微弱的荧光信号，这可能是由于在肿瘤部位激活的CTBA-NPs通过消化系统进一步代谢所致。但由于其荧光信号与肿瘤组织相比非常低，因此在体内肿瘤成像时不会影响NIR-II成像的准确性。这些结果表明，由于CTBA-NPs能够被一氧化氮特异性激活，因此可以作为NIR-II肿瘤显像剂用于肿瘤诊断和治疗。
CTBA-NPs的体内抗肿瘤效率
为了验证CTBA-NPs的光疗潜力，随后在H22荷瘤小鼠中评估了其体内抗肿瘤作用。H22细胞皮下接种于BALB/C小鼠。当肿瘤长至200±50 mm3，将荷瘤小鼠随机分为6组，每组4只:(1)pbs处理组;(2)激光pbs处理组;(3) ctba - nps处理组;(4)激光ctba - nps处理组。CTBA-NPs在肿瘤微环境中被过量的一氧化氮激活后，在808 nm激光照射下表现出明显的光热效应。肿瘤部位温度可升高20℃以上，这与体外光热实验结果一致。从接种肿瘤开始，每隔2天测量各组的体重和肿瘤体积。各组小鼠体重无显著差异。G1、G2和G3组肿瘤生长迅速，无明显抑制作用，说明单次808 nm激光照射或注射CTBA-NPs均不能杀死肿瘤细胞。值得注意的是，当CTBA-NPs与808 nm激光协同治疗时，肿瘤体积明显缩小甚至消失。这可能是由于在激光照射下，一氧化氮激活的CTBA-NPs产生细胞毒性ROS，表现出明显的光热效应。此外，治疗后各组肿瘤的H&E染色进一步评价CTBA-NPs的抗肿瘤能力。治疗组肿瘤组织图像在光激发下出现明显的细胞核损伤，提示细胞凋亡和坏死。
结论
我们设计并合成了一种可被一氧化氮激活的D-p-A-p-D型NIR-II综合诊断和治疗荧光探针。采用高电子密度电子供体CPDT与一氧化氮结合反应基团苯并[c][1,2,5]噻二唑-5,6-二胺受体得到小分子荧光团CTBA。并用PS1000–PEG2000封装CTBA形成CTBA-NPs。当肿瘤微环境中过量的一氧化氮激活CTBA-NPs时，受体部分的邻苯二胺基可转化为电子密度较低的三唑基。因此，探测器的发射波长会从白光向NIR-II窗口发生明显的红移。同时，在808 nm激光照射下，表现出明显的光动力和光热性能。值得注意的是，可活化的CTBA-NPs成功应用于小鼠肿瘤的精确NIR-II成像和PDT/PTT协同治疗。这项工作为设计可活化的NIR-II探针铺平了道路，并为肿瘤的精确诊断和成像引导的协同光疗提供了新的策略。
参考文献
Nitric oxide-activatable NIR-II organic small molecule for fluorescence imaging-guided synergistic photodynamic and photothermal therapy. Xinyi Zhang, Ling Li, Yuxin Ren, Meiqi Li, Xinyi Ma, Yajie Long, Junqing Wang and Yanli Tang*. Chem. Sci, 2025, 16, 15194-15205，DOI: 10.1039/d5sc03636d
