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内容提要

   本研究基于共轭聚合物IN-DPP和一氧化碳(CO)载体聚合物mPEG(CO)开发了用于光热增强气体治疗的纳米治疗剂(IN-DPPCO NPs)。IN-DPPCO NPs可以通过过氧化氢(H₂O₂)在肿瘤微环境中过表达释放CO。同时，IN-DPPCO NPs在近红外窗口表现出较强的吸收，在808 nm激光照射下光热转换效率高达41.5%。体外和体内实验表明，这些纳米治疗剂表现出良好的生物相容性。此外，与单独气体治疗相比，CO/光热协同治疗显示出更高的治疗效果。

结果与讨论

纳米颗粒的合成与表征

   本研究使用Stille偶联反应合成了共轭聚合物IN-DPP。以十二羰基三铁和巯基聚乙二醇(mPEG2000-SH)为原料，合成了CO存储聚合物mPEG(CO)。通过纳米再沉淀法制备了共轭聚合物纳米颗粒。简而言之，将IN-DPP和mPEG(CO)快速加入水中形成IN-DPPCO NPs。透射电镜(TEM)显示，IN-DPPCO NPs呈球形，平均直径为68 nm。DLS分析表明，IN-DPPCO NPs和IN-DPP NPs的平均水动力直径分别约为80 nm和90 nm。显示了IN-DPP NPs和IN-DPPCO NPs的吸收光谱。值得注意的是，IN-DPPCO NPs和IN-DPP NPs在808 nm处都有一个共同的吸收峰。为了评估纳米颗粒的吸收能力，进一步测定了808 nm处的峰值质量消光系数为85.82 L g^-1cm^-1，高于之前报道的氧化石墨烯(5.94 L g^-1cm^-1)。这些发现使得它们非常适合作为近红外(NIR)激活光热疗法的光热剂。IN-DPP NPs的zeta电位为53 mV，而IN-DPPCO NPs的zeta电位为47 mV。这可以归因于两亲性功能聚合物的存在，即PSMA和mPEG(CO)。

IN-DPP NPs和IN-DPPCO的光热性质

   显示了不同浓度(0 ~ 150 mg mL^-1)下IN-DPPCO NP和IN-DPP NP溶液的温度分布。这些温度分布是在将溶液置于1.0 W cm²强度的808 nm激光照射下获得的。结果表明，溶液的最高温度随着溶液浓度的降低而降低。此外，IN-DPPCO NP和IN-DPP NP溶液的温度通过使用不同的激光功率密度(0.2至1.0 W cm²)而改变。发现揭示了IN-DPPCO NPs和IN-DPP NPs对近红外激光功率密度的明显依赖。此外，光热转换效率是评估光热转换能力的关键参数。在808 nm激光(1.0 W cm²)下，IN-DPPCO NP溶液在10分钟内温度可达到59.7℃。同时，IN-DPP NPs溶液的温度也可以达到55.4℃。此外，IN-DPPCO NPs和IN-DPP NPs的光热转换效率分别为41.5%和29.1%。为了评估IN-DPPCO NP和IN-DPP NP溶液的光热稳定性，观察了回收后的温度波动。IN-DPPCO NPs和IN-DPP NPs在五个快速加热/冷却循环中表现出一致的光热转换性能。随后，利用红外热像仪记录了溶液在激光照射(1.0 W cm²)下的温度变化。IN-DPPCO NP溶液的峰值温度为59.4℃，满足光热治疗的散热标准。这些发现表明，IN-DPPCO NPs有望成为光热治疗的潜在选择。

IN-DPPCO的无释放性能

   为了确认IN-DPPCO NPs的CO释放能力，使用还原血红蛋白(Hb)来测试CO含量。通过分析还原Hb和HbCO的吸收峰值可以确定CO的含量。研究表明，肿瘤微环境中H₂O₂的浓度通常落在每升微摩尔的范围内。在0、10、20、30和40 mM的H₂O₂浓度下进行了90分钟的测试，以评估IN-DPPCO NPs在肿瘤微环境中释放CO的情况。在没有H₂O₂的情况下，CO的释放是最小的。然而，当H₂O₂浓度接近肿瘤细胞中的水平时，IN-DPPCO NPs表现出大量的CO释放，证实了其特殊的CO释放能力。同时，合成RCO探针并用于量化细胞内CO释放水平。在560nm处表现出吸收变化，在约580nm处荧光明显增加。重要的是，证实了近红外(NIR)光对实验的影响可以忽略不计。利用荧光显微镜检测细胞内RCO的荧光信号。仅在mPEG(CO)或IN-DPPCO NPs处理过的癌细胞(4T1)中观察到来自RCO的强大荧光信号，而正常细胞(293T)没有表现出这样的信号。这一发现强烈表明，mPEG(CO)和IN-DPPCO NPs在肿瘤微环境中选择性释放CO气体，其特征是H₂O₂水平升高。

体外细胞毒性测试

   虽然IN-DPPCO纳米颗粒已经显示出作为一氧化碳(CO)供体的潜力，但在考虑其在生物医学应用的下一步之前，它们的细胞毒性需要进一步研究。MCF-7、HepG2、293T和HeLa细胞分别用不同浓度的IN-DPP NPs和IN-DPPCO NPs孵育。通过使用MTT法评估细胞活力。在不同浓度的IN-DPP NPs孵育24小时后，未观察到细胞活力明显降低。这表明IN-DPP NPs在没有光照的情况下表现出较低的细胞毒性。值得注意的是，即使在没有NIR照射的情况下，IN-DPPCO NPs也表现出对癌细胞的细胞毒性作用，这可能是由于一氧化碳(CO)固有的抗肿瘤特性。此外，值得注意的是，IN-DPPCO NPs没有在正常细胞(293T细胞)中表现出明显的毒性，进一步证实了IN-DPPCO NPs的生物安全性。这些结果表明，IN-DPPCO NPs在肿瘤细胞微环境的刺激下能够响应性释放CO。此外，将孔置于808 nm激发光(1.0 W cm²)下10 min后，细胞活力明显下降。在NIR光照射下，IN-DPPCO NPs浓度为100 mg mL 1的癌细胞存活率可降至约10%，低于激光照射下IN-DPP NPs处理的细胞。此外，IN-DPPCO NPs在没有光照射的情况下与正常细胞具有生物相容性，但其显著的光热治疗效果是由于IN-DPP NPs具有较高的光热转换效率，与光热转换效率匹配良好。同时，IN-DPPCO NPs与100 mg mL^-1 IN-DPPCO NPs在NIR光照射下，293T细胞的存活率可降低至32%左右，高于IN-DPPCO NPs对癌细胞的存活率。也就是说，这种纳米颗粒不仅适用于肿瘤治疗，而且由于其光热能力和H₂O₂-触发一氧化碳释放能力，被赋予了优越的治疗效果。为了全面评价纳米颗粒的光热性能，利用吖啶橙/溴乙基(AO/EB)双荧光染料技术检测HeLa细胞的凋亡情况。表明在没有光照的情况下，IN-DPP NPs没有表现出明显的细胞毒性。IN-DPPCO NPs即使在没有光照射的情况下也能对肿瘤细胞发挥细胞毒性作用，这主要归因于肿瘤微环境H₂O₂刺激后释放的一氧化碳。在有光的情况下，与对照组相比，IN-DPPCO NPs治疗后的细胞毒性显著增强。这些发现与MTT试验中观察到的结果一致，表明光热和CO治疗联合应用在治疗效果方面可能优于单独使用的任何一种治疗。

IN-DPPCO NPs的体内肿瘤根除

   采用BALB/c小鼠4T1乳腺肿瘤模型，在体内评价in- dppco NPs的联合抗肿瘤功效。30只患有4T1乳腺肿瘤的BALB/c小鼠被分为6个不同的组。各组分别接受以下处理:(1)PBS， (2) PBS +光，(3)IN-DPP NPs， (4) IN-DPP NPs +光，(5)IN-DPPCO NPs， (6) IN-DPPCO NPs +光。必须强调的是，第一组、第三组和第五组没有接受808 nm激光照射。相反，其他组在给药后12 h和48 h分别接受808 nm激光照射10 min。在28天的时间里，对所有组的肿瘤体积和体重进行了定期评估。在第28天，收集肿瘤样本进行分析。采用红外成像技术来评估小鼠对治疗的热反应。肿瘤内给药PBS肿瘤温度仅升高34.3℃。相比之下，注射IN-DPP NPs或IN-DPPCO NPs导致温度迅速而大幅上升，在激光照射下达到约55℃的峰值。结果表明，IN-DPP NPs和IN-DPPCO NPs均表现出良好的体内光热效应。在黑暗和808 nm激光照射条件下，小鼠的体重基本保持不变，从而验证了纳米材料良好的生物相容性。在28天的时间里密切监测了小鼠的肿瘤体积。值得注意的是，与其他组相比，在808 nm激光照射下，IN-DPPCO NP组和IN-DPP NP组的肿瘤体积均显着减少。同时，值得注意的是，与IN-DPP NP组相比，IN-DPPCO NP组肿瘤体积的缩小更为明显。这一观察结果表明，光热和气体疗法的结合治疗效果优于光热疗法或气体疗法本身。此外，值得强调的是，四个对照组小鼠的平均寿命为16至20天，明显短于IN-DPP NPs + Light组和IN-DPPCO NPs + Light组。此外，与IN-DPP NPs + Light组相比，IN-DPPCO NPs + Light组的平均寿命更长。这一额外的观察结果强调了IN-DPPCO NPs抗肿瘤效果的增强。值得注意的是，与其他实验组相比，IN-DPPCO NPs + Light组的肿瘤体积显着减少，从而进一步验证了IN-DPPCO NPs与激光照射联合治疗的显着协同治疗效果。因此，可以推断出肿瘤抑制作用与对照组相比，IN-DPPCO NPs + Light组的效果最为显著。

结论

   本研究建立了一种基于共轭聚合物纳米治疗剂的H₂O₂-触发可控一氧化碳递送，用于光热增强气体治疗。IN-DPPCO NPs集成了两个重要功能，即近红外光触发光热治疗和H2O2-respondedCO生成，以协同癌症治疗。此外，IN-DPPCO NPs具有良好的生物相容性，光热转换效率高达41.5%。此外，肿瘤微环境中高浓度的H2O2也可触发mPEG(CO)分解生成CO，因此IN-DPPCO NPs的治疗效果明显优于气体治疗。

参考文献

H₂O₂-triggered controllable carbon monoxide delivery for photothermally augmented gas therapy，Kaiwen Chang, Xiaolin Sun, Mingying Fu, Bing Han, Xiaopeng Jiang, Qiaofang Qi, Yang Zhang, Tianjun Ni, Chunpo Ge and Zhijun Yang，J. Mater. Chem. B, 2024, 12, 2737，https://doi.org/10.1039/d3tb02399k.