内容提要
本文合理设计了一种双激活光声（PA）探针 AcDEVDFFG-Hcy-BOH（P1），该探针可响应 MI/R 损伤的两种标志性生物标志物：活性氧（ROS）和半胱天冬酶 - 3（Caspase-3）。P1 包含四个功能结构域：亲水性 DEVD 肽（Caspase-3 底物及亲水性增强剂）、二苯丙氨酸（FF）基序（自组装单元）、半花菁（PA 发色团）以及过氧化氢（H₂O₂）响应型硼酸基团（掩蔽半花菁的 PA 信号）。在 ROS 和 Caspase-3 水平升高的 MI/R 病理微环境中，P1 首先经 H₂O₂触发硼酸基团裂解以脱掩蔽半花菁，随后发生 Caspase-3 介导的 DEVD 水解。这种双激活作用促使 P1 形成自组装纳米颗粒，导致显著的荧光猝灭和相应的 PA 信号增强。在体外实验、缺氧 / 复氧诱导的心肌细胞模型以及小鼠 MI/R 损伤模型中，P1 的 PA 信号分别比未激活状态增强了 6.9 倍、5.3 倍和 4.8 倍。相比之下，缺乏 ROS 响应性（P2）或 Caspase-3 响应性（P3）的对照探针表现出明显更弱的 PA 信号。
结果与讨论
探针的合成与表征
我们合成并表征了探针 P1。同时合成并表征了两种对照探针 P2（AcDEVDFFG-Hcy-Bz，对 Caspase-3 响应但对 ROS 不敏感）、P3（AcDEDVFFG-Hcy-BOH，对 ROS 响应但对 Caspase-3 不敏感）以及双激活产物 FFG-Hcy。为选择合适的体外实验探针浓度，我们测定了 P1 和双激活产物 FFG-Hcy 的临界聚集浓度（CAC）。在含 1% 二甲基亚砜（DMSO）的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，P1 和 FFG-Hcy 的 CAC 值分别为 100.6 μM 和 27.1 μM，因此，我们选择 50 μM（介于上述两个数值之间）作为体外实验的探针浓度。在此浓度下，P1 保持解离分子状态，而双激活产物 FFG-Hcy 会发生聚集。随后，我们利用高效液相色谱（HPLC）验证 P1 对 ROS 和 Caspase-3 的响应性：ROS 响应性分析中，50 μM P1 与 100 μM 过氧化氢（H₂O₂）孵育 12 h；Caspase-3 响应性分析中，50 μM P1 与 1 μg/mL Caspase-3 在其工作缓冲液中孵育 24 h；双响应性分析中，50 μM P1 先与 100 μM H₂O₂孵育 12 h，再与 1 μg/mL Caspase-3 孵育 24 h 后进行 HPLC 分析。 “P1+Caspase-3” 组的 HPLC 图谱中出现了一个保留时间为 12.9 min 的新峰，经鉴定为酶切产物 FFG-Hcy-BOH，证实了 P1 对 Caspase-3 的响应性；“P1+H₂O₂” 组中，P1 的原始 HPLC 峰完全消失，出现一个保留时间为 12.2 min 的新峰，经鉴定为 ROS 激活产物，表明 P1 可被 ROS 高效激活；值得注意的是，“P1+H₂O₂+Caspase-3” 组中出现了对应 FFG-Hcy 的 HPLC 峰（保留时间：10.4 min），并通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析进一步验证。相比之下，对照探针 P2 和 P3 经 H₂O₂和 Caspase-3 依次处理后，未检测到对应 FFG-Hcy 的 HPLC 峰。此外，HPLC 结果证实 P2 和 P3 分别对 H₂O₂和 Caspase-3 无响应，验证了这些对照探针的设计功能，为证实 P1 的双激活机制提供了支持。
探针的光物理性质
紫外 - 可见（UV-Vis）吸收光谱显示 P1 在 613 nm 和 661 nm 处有两个吸收峰。在上述条件下用 H₂O₂处理 P1 后（“P1+H₂O₂” 组），在 685 nm 处检测到一个新的吸收峰；P1 经 H₂O₂和 Caspase-3 依次处理后（“P1+H₂O₂+Caspase-3” 组）以及 P3（对 ROS 响应但对 Caspase-3 不敏感）经 H₂O₂和 Caspase-3 依次处理后，也观察到了该光谱变化，表明 H₂O₂可诱导 P1 上半花菁基团的脱掩蔽。相比之下，“P1+Caspase-3” 组以及 P2（对 Caspase-3 响应但对 ROS 不敏感）经 H₂O₂和 Caspase-3 依次处理后，未观察到 685 nm 处的吸收峰，这是由于 P1 和 P2 上的半花菁基团仍处于掩蔽状态。荧光光谱分析表明，H₂O₂处理后的 P1 和 P3 表现出强荧光信号，发射峰最大值分别位于 716 nm 和 719 nm，峰值荧光强度分别是未处理 P1 和 P3 的 6.2 倍和 5.8 倍，表明 H₂O₂确实可通过脱掩蔽激活 P1 和 P3，诱导荧光发射。值得注意的是，当 P1 经 H₂O₂和 Caspase-3 依次处理后，荧光信号显著减弱，这是由于双激活产物 FFG-Hcy 组装形成纳米颗粒，通过聚集诱导猝灭（ACQ）效应导致荧光猝灭。这是分子聚集中的一种常见现象，发色团聚集通过促进非辐射衰减途径抑制荧光发射。双激活后，释放的 FFG-Hcy 自组装形成纳米颗粒，引发 ACQ 效应。因此，尽管 “P1+H₂O₂+Caspase-3” 组和 “P1+H₂O₂” 组在～685 nm 处的紫外 - 可见吸收强度相当，但 “P1+H₂O₂+Caspase-3” 组中的组装纳米颗粒通过非辐射弛豫将吸收的光子能量高效转化为热能（而非荧光），从而产生显著增强的 PA 信号；相比之下，“P1+H₂O₂” 组中未组装的 ROS 激活产物主要发生辐射衰减（荧光），导致 PA 信号较弱。为证实组装现象，我们对经 H₂O₂和 Caspase-3 处理后的 P1 进行了透射电镜（TEM）分析。TEM 图像显示，未处理的 50 μM P1 未观察到可检测的纳米结构，而经 H₂O₂和 Caspase-3 处理后的 P1 形成了均匀的纳米颗粒，平均直径为 42.7±7.7 nm，该结果验证了 P1 经双激活后会发生组装。我们评估了 P1 的体外光声（PA）性质。在 700 nm 激光激发下，50 μM 未处理的 P1 仅产生微弱的 PA 信号；单独与 Caspase-3 孵育后，P1 的 PA 信号无显著变化；而经 100 μM H₂O₂处理后，PA 信号适度增强，达到未处理 P1 的约 2.7 倍。值得注意的是，经 H₂O₂和 Caspase-3 依次处理后，PA 信号显著放大，达到未处理 P1 的 6.9 倍。相比之下，两种对照探针 P2 和 P3 在相同双处理（H₂O₂+Caspase-3）条件下，PA 信号显著更低，其信号强度分别仅为双激活 P1 的 17.3% 和 31.9%。综上，这些结果证实 P1 在体外可实现 H₂O₂和 Caspase-3 调控的 PA 激活。
细胞缺氧 / 复氧（H/R）损伤模型中的光声成像
我们在 H9c2 心肌细胞缺氧 / 复氧（H/R）损伤模型中进行了 P1 的体外 PA 成像研究。成像前，我们通过 CCK-8 细胞毒性实验评估了 P1 的生物相容性。H9c2 细胞与 50 μM P1 孵育 24 h 后，存活率为 93.2±3.1%，证实了 P1 在测试浓度下具有良好的体外生物相容性。我们还评估了探针在生理相关条件下的稳定性：将 50 μM 的 P1、P2 和 P3 分别在 PBS 缓冲液（pH 7.4）和含 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中于 37 °C 孵育，模拟生理环境和细胞培养环境，通过 HPLC 监测 96 h 内的稳定性（该时长远超本研究 6 h 的体内成像窗口）。结果表明，三种探针在这些条件下均保持高度稳定，96 h 内 HPLC 图谱（保留时间和峰面积）无显著变化，证实探针在生理相关条件下保持结构完整性，不会发生非特异性降解。为在体外模拟 MI/R 损伤，我们通过将 H9c2 细胞暴露于缺氧环境（1% O₂）6 h，随后在常氧条件（21% O₂）下复氧 12 h，建立了 H/R 损伤模型。细胞 PA 成像实验中，H9c2 细胞分为四组：对照组（未进行缺氧 / 复氧处理，与 50 μM P1 孵育 6 h）、H/R+P1 实验组（MI/R 模型细胞与 50 μM P1 孵育 6 h）、H/R+P2 组（MI/R 模型细胞与 50 μM P2 孵育 6 h）、H/R+P3 组（MI/R 模型细胞与 50 μM P3 孵育 6 h）。孵育后，洗涤各组细胞并离心，重悬于含 1.0 wt% 琼脂糖的 PBS 中进行 PA 分析。由于 ROS 和 Caspase-3 基础水平较低，对照组在 700 nm 处表现出微弱的 PA 信号；而 H/R 实验组（H/R+P1）表现出强得多的 PA 信号，强度达到对照组的 5.3 倍。相比之下，H/R+P2 组和 H/R+P3 组的 PA 信号分别仅为 H/R 实验组的 26.2% 和 51.1%（均 p<0.01）。为进一步证实 P1 在细胞内的激活和自组装，我们对 H/R 实验组进行了透射电镜（TEM）观察。TEM 图像清晰显示细胞内存在纳米颗粒，平均直径为 51.2±10.8 nm；而对照组细胞中未检测到此类纳米结构。这些观察结果表明，P1 在损伤细胞内发生了双激活和后续自组装。综上，这些结果证实 P1 可通过选择性响应 H/R 损伤相关的 ROS 和 Caspase-3 升高，实现 H9c2 心肌细胞的灵敏且特异性 PA 成像。
小鼠心肌缺血再灌注（MI/R）模型中的光声成像
我们在小鼠心肌缺血再灌注（MI/R）模型中进行了体内 PA 成像，以评估探针的性能。通过开胸暴露心脏，结扎左前降支冠状动脉（LAD）45 min，随后恢复缺血心肌组织的再灌注，建立 MI/R 模型。将小鼠随机分为四组：对照组（开胸但不结扎冠状动脉，腹腔注射 1.0 μmol/kg P1）、MI/R 实验组（MI/R 模型小鼠，腹腔注射 1.0 μmol/kg P1）、MI/R+P2 组（MI/R 模型小鼠，腹腔注射 1.0 μmol/kg P2）、MI/R+P3 组（MI/R 模型小鼠，腹腔注射 1.0 μmol/kg P3）。探针注射 6 h 后，在 700 nm 激光激发下进行体内 PA 成像。MI/R 实验组心肌组织的 PA 信号显著增强，强度达到对照组的 4.8 倍，这种增强归因于缺血心肌中 H₂O₂和 Caspase-3 水平升高，触发了探针激活。相比之下，两个对照组的 PA 信号强度显著更低：MI/R+P2 组和 MI/R+P3 组的信号分别仅为 MI/R 实验组的 27.8% 和 48.8%（p<0.01）。这些结果验证了依赖双激活机制（需 ROS 和 Caspase-3 共同激活）的 P1，不仅显著提高了 PA 成像对比度，还实现了 MI/R 损伤的体内特异性可视化。对照组信号减弱进一步证实，这种特异性依赖于 MI/R 相关生物标志物的共存（而非非特异性激活），因为对照探针 P2 和 P3 无法被 MI/R 微环境完全激活。
结论
通过合理设计双激活分子探针 P1，我们建立了一种新型光声（PA）成像策略，实现了心肌缺血再灌注（MI/R）损伤的特异性可视化。这种特异性源于 P1 对 MI/R 损伤微环境中 ROS 和 Caspase-3 升高水平的选择性响应。在 MI/R 损伤条件下，探针 P1 发生双激活：首先，ROS 触发硼酸基团裂解；其次，Caspase-3 介导 DEVD 肽键水解。这种双激活释放出 FFG-Hcy 片段，自组装形成平均直径为 42.7±7.7 nm 的纳米颗粒，同时伴随 PA 信号的显著增强。体外研究证实，P1 对双刺激具有显著的信号增强效果：纳米颗粒形成后，PA 强度增加了 6.9 倍。在细胞模型中，探针 P1 在缺氧 / 复氧处理（模拟 MI/R 损伤）的 H9c2 心肌细胞中实现了 5.3 倍的 PA 信号增强。在体内研究中，与对照组相比，其在小鼠 MI/R 模型心肌中实现了 4.8 倍的 PA 信号增强。缺乏 ROS 响应性（P2）或 Caspase-3 响应性（P3）的两种对照探针，在相同条件下均表现出显著更低的 PA 信号，证实 P1 对 MI/R 损伤的增强 PA 成像是依赖于双激活机制，而非非特异性刺激。
参考文献
ROS and Caspase-3 Dual-Activated Photoacoustic Probe for Enhanced Imaging of Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury. Penghao Zhen,Xianbao Sun*,Ya Hu,Fuchao Yu,Xuan Xu,Qin Wei,Qiaochu Jiang,Xiaoyang Liu,Gaolin Liang*,Jiayi Tong*, Anal. Chem., 2025, 97, 24270−24278. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c05680
