内容提要
本研究介绍FC-1，一种双串联可激活的荧光探针，旨在通过同时靶向成纤维细胞激活蛋白α和组织蛋白酶C (CTSC)来精确诊断cSCC。这种双锁激活策略有效地减少了正常组织中的非特异性信号，同时提高了诊断特异性。在SCC-7异种移植小鼠的体内研究表明，FC-1具有高灵敏度和特异性的皮下肿瘤可视化能力。此外，FC-1能够明确区分cSCC和瘢痕疙瘩。该探针的双激活机制和强大的性能强调了其作为早期cSCC检测和鉴别。
实验结果与讨论
探头的合理设计
与单锁探针相比，酶激活双锁探针显著降低了假阳性信号的发生率，解决了生物活性物质固有的低特异性问题，并实现了精确成像。我们开发了一种双酶近红外(NIR)荧光探针，能够被FAPα和CTSC特异性和顺序激活。所开发的探针(FC-1和FC-2)包括两个主要成分:四肽(Ac-Gly-Pro-Gly-Phe或Cbz-Gly-Pro-Gly-Phe)作为识别单元，选择性靶向FAPα和CTSC，NIR半菁染料(HD-OH)作为荧光报告细胞。这些组分通过自焚的4-氨基苄醇(PABA)间隔物连接。在完整探针中，HD-OH的分子内电荷转移(ICT)过程被抑制，导致荧光猝灭。经过FAPα的特异性酶切，探针经过初始水解生成Gly-Phe-PABA-HD，这是一种非荧光中间体。随后CTSC的蛋白水解激活去除二肽Gly-Phe，启动PABA间隔物的1,6-自消除级联这种结构重排暴露了pba的羟基HD-OH)，在生理条件下发生去质子化形成供电子的酚酸阴离子。这种去质子化增强了ICT过程，从而恢复了NIR荧光发射。此外，我们通过将半花青碱染料(HD-OH)与FAPα识别片段(Cbz-Gly-Pro)偶联构建了一个单锁探针。
探针的光谱特性
为了验证FC-1和FC-2的双酶激活性能，我们系统地评估了它们在FAPα和CTSC顺序激活下的近红外吸收和荧光发射谱。FC-1在600和645 nm处有两个吸收峰，在680 nm处有微弱的荧光发射。在FAPα和CTSC存在下，FC-1在600 nm处的吸收峰减弱，在690 nm处出现新的吸收峰。此外，与FAPα和CTSC共同作用后，FC-1的荧光波长红移至715 nm，强度增强了11倍，表明对两种酶都有较强的荧光响应。而单独添加FAPα或CTSC时，FC-1的荧光强度没有明显变化。相比之下，FC-2与FAPα和CTSC孵育3小时后，其吸收和荧光波长和强度仅发生轻微变化。这些结果表明，与FC-2相比，FC-1对FAPα和CTSC表现出更强的响应性。这种差异可能是由于FC-1和FC-2表达FAPα。此外，我们还研究了参考探针F-1对FAPα的荧光响应。与FAPα孵育后，F-1在715 nm处的荧光强度增强了19倍。随后，评估FC-1在生理温度(37℃)和pH(7.4)下的稳定性。FC-1在715 nm处的荧光在4小时的时间内显示出可忽略不计的增加(<5%)，表明该探针具有优越的稳定性。相比之下，与FAPα和CTSC孵卵后，FC-1表现出时间依赖性的荧光强度增加(在4小时内约为11.7倍)，验证了探针的酶特异性激活。接下来，我们研究了探针对各种酶和其他分析物的选择性，如醌脱氢酶1 (NQO1)、组织蛋白酶B (CTSB)、caspase-3、碱性磷酸酶(ALP)、芳基硫酸化酶(ARS)、颗粒酶B (GrzB)、白三烯A4水解酶(LTA4H)。探针FC-1在除FAPα和CTSC以外的生物分子存在时表现出极小的荧光增强。这些发现证实，FC-1在同时检测FAPα和CTSC方面表现出卓越的选择性，强调了其作为这些酶靶点的特定诊断工具的潜力。此外，我们还通过HPLC分析证实了FAPα和CTSC对FC-1的激活机制。FC-1的保留时间为14min, HD-OH的保留时间为10 min。FC-1与FAPα和CTSC的混合溶液在37℃下孵育2 h，观察到分解产物HD-OH。通过FAPα和CTSC确认酶促裂解探针，随后暴露荧光团的羟基。
活细胞内源性FAPα和CTSC的荧光成像
验证的机制促使通过细胞水平研究进一步研究，以评估其在体外和体内模型中的生物活性潜力。为了评估FC-1激活细胞成像的能力，首先在SCC7细胞中使用MTT法评估其细胞毒性，MTT法是一种广泛使用的评估细胞活力的方法。20 μM FC-1处理后，细胞存活率保持在80%以上，表明探针具有低细胞毒性和良好的生物相容性。选择小鼠来源的SCC模型SCC7细胞系，评估探针在活细胞中的酶激活(FAPα和CTSC)潜力。为了评估FC-1在细胞背景下的功能适用性，我们进行了实时活细胞成像，同时监测SCC7细胞内FAPα和CTSC的活性。SCC7细胞与FC-1孵育不同时间(15,30和60分钟)，在红色通道中显示出红色荧光发射，荧光强度在60分钟达到峰值。这些发现证实了FC-1有效地可视化SCC7细胞，突出了其在时间依赖性活细胞成像应用中的潜力。为了证实FC-1的激活同时依赖于FAPα和CTSC，我们建立了四个实验组:A组(FAPα抑制)，用10 μMSP13786 (FAPα选择性抑制剂)预处理SCC7细胞0.5 h，然后用FC-1孵育1 h;B组(抑制CTSC)，用20 μM E-64(选择性CTSC抑制剂)预处理细胞1小时，然后用FC-1孵育1小时;C组(双抑制)细胞分别与E-64 (20 μM, 1 h)和SP13786 (20 μM, 0.5 h)共处理，然后与FC-1孵育1 h;D(对照组)，细胞单独接受FC-1。共聚焦成像仅在D组显示出强大的荧光，而A-C组的荧光强度明显降低。总的来说，这些发现证实了FC-1需要内源性FAPα和CTSC的顺序蛋白水解激活。从而允许在活细胞中对它们的活性进行时空荧光成像,为了评估FC-1区分SCC和正常细胞的能力，我们评估了它的荧光成像用于肿瘤治疗中具有更强的可控性。在SCC7和3T3-L1(小鼠成纤维细胞系)细胞中的表现。FC-1培养的SCC7细胞近红外荧光强度显著增加，而在相同实验条件下，3T3-L1细胞的荧光信号强度可以忽略不计。这些结果共同表明，FC-1特异性区分SCC7和3T3-L1细胞基于它们的差异酶活性。
体内肿瘤成像
鉴于FC-1在体外具有强大的荧光成像能力，我们随后使用cSCC荷瘤小鼠模型评估了其体内肿瘤靶向诊断效果。将预培养的SCC7细胞注射到BALB/c小鼠右后肢，建立皮下cSCC肿瘤模型。皮下cSCC肿瘤生长7天后进行体内荧光成像实验。FC-1通过皮下注射到左侧(指定为正常组织)和瘤内注射到右侧(肿瘤组织)。注射后肿瘤部位的荧光强度迅速增加，达到峰值，相对于基线水平增加3.6倍，而在正常组织中检测到最小的信号变化。这些结果证实，FC-1在肿瘤组织中被选择性和酶激活，从而促进了在临床前环境中实现cSCC高对比度体内成像的前景。为了确定肿瘤组织中FC-1的激活是否依赖于FAPα和CTSC，我们对cSCC BALB/c裸鼠模型进行了药理学抑制实验。通过注射SCC7细胞在小鼠体内产生皮下肿瘤，在进一步分析之前，将荷瘤小鼠培养7天。实验组小鼠分别通过静脉和腹腔注射SP13786(一种FAPα抑制剂)和E-64(一种CTSC抑制剂)预处理，然后间隔1小时后瘤内给药FC-1。对照组给予PBS，在相同条件下给予肿瘤内FC-1。在9小时的观察期内进行纵向荧光成像，以监测探针的激活动态。对照组的荧光强度迅速增加，给药后5小时肿瘤区域内的信号强度增加了16.4倍。相比之下，抑制剂治疗后组只增加了5.8倍。在5 h时间点，对照组的荧光信号强度比抑制剂处理组高2.8倍，差异有统计学意义。这些结果共同证实了肿瘤微环境中FAPα和CTSC的酶活性介导了FC-1的肿瘤特异性激活。
cSCC与瘢痕组织的鉴别
先前的研究表明，相对于正常成纤维细胞，FAPα在瘢疙瘩成纤维细胞中明显过表达，它在瘢痕疙瘩中观察到的伤口边界扩张的病理进展中起关键作用为了验证FC-1双锁激活策略在减少非特异性瘢痕疙瘩组织激活方面的作用，我们在cSCC和瘢痕疙瘩组织切片上对FC-1和单锁F-1进行了比较荧光成像分析。新切除的cSCC和瘢痕疙瘩组织的组织学特征采用苏木精和伊红(H&E)染色进行表征。将新鲜切除的cSCC组织和瘢痕疙瘩组织样本冷冻切片，用FC-1或F-1 (20 μM)处理1小时，然后通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)成像,瘢痕疙瘩和cSCC组织用F-1孵育后均表现出较强的荧光信号。相比之下，cSCC组织的荧光强度明显高于瘢痕疙瘩组织，这表明FC-1在肿瘤微环境中优先激活。这些发现证实，FC-1特异性靶向肿瘤相关酶活性(FAPα和CTSC)，同时最小化非恶性瘢痕疙瘩组织中的非特异性激活，符合其双锁设计策略。
结论
FC-1是一种双酶级联激活探针，旨在利用cSCC中FAPα和CTSC的内源性上调，促进cSCC的准确鉴别诊断和治疗评估。FC-1经过FAPα和CTSC的连续酶切，产生荧光团HD-OH，因此对cscc相关的酶活性具有高选择性。该探针有助于小鼠cSCC肿瘤的实时体内成像，并在离体研究中可靠地区分cSCC组织和瘢痕疙瘩组织。这种“双锁”设计策略保证了FC-1在FAPα和CTSC存在时的特异性激活，从而能够精确区分cSCC组织和瘢痕疙瘩组织。然而，FC-1也有一定的局限性，比如响应时间相对较长。这种延迟很可能是由于串联锁设计中激活所需的顺序酶裂解。为了克服这一点，未来的设计可能会采用并行锁策略，允许任一酶独立和同时激活，从而实现更快的响应。此外，体内的信噪比仍然不是最优的，这表明需要进一步优化探针的设计和性能。总的来说，这种方法对于cSCC的早期和特异性检测具有相当大的临床潜力，从而解决了皮肤肿瘤学的关键需求。例如，FC-1可以配制为局部给药，例如以凝胶或微针贴片的形式。这些给药策略提供了非侵入性的、对患者友好的替代方案，可能有助于在浅表皮肤病变内有效地渗透和激活探针。这样的配方将进一步提高FC-1的临床适用性，支持其在无创诊断或cSCC术中显像中的应用。
参考文献
Enzyme-activatable dual-locked fluorescent probe for precision imaging of cutaneous squamous cell carcinoma，Yanhua Li， Shan Zuo， Yushi Chen， Junliang Zhou， Ling Shi，Lin Yuan，Smart Mol. 2025;3:e70018，https://doi.org/10.1002/smo2.70018
