内容提要
本研究开发一种通用分子工程策略，使BODIPY具备螺环功能。在中位引入2-（羟甲基）苯基或2-羧基苯基作为分子内亲核试剂，同时在α/β位引入吸电子基团以调节核心电子密度并增强中位碳的亲电性。首次报道了螺环化BODIPY的单晶X射线结构，明确证实闭环形式及闪烁机制。通过系统调控，建立了清晰的pKa构效关系，能够精确预测和定制开环-闭环平衡。所得到的具有螺环化能力的BODIPYs表现出高达约87122 M-1 cm-1的优异亮度，并能在低功率激光密度（≥32 W cm-2）对活细胞中的线粒体和溶酶体进行自闪烁超分辨成像，且无需成像增强缓冲液。
实验结果与讨论
首先合成了具有各种EWG的内消旋-(2-(羟甲基)苯基)取代的BODIPY A1-A8。通过Knoevenagel缩合反应制备了α-芳基乙烯基取代的BODIPY，扩展BODIPY为核心的π共轭体系。精确调控α位芳基乙烯基取代基的电子效应和β位氯代反应，合成了内消旋-(2-(羟甲基)苯基)功能化BODIPYs A1-A8。以A5为例，β-氯原子和α-3,5-双（三氟甲基）苯乙烯基取代基的强吸电子效应显著降低了BODIPY核心的电子密度。DFT计算表明，中位碳原子对LUMO的贡献最大，表明其具有强亲电性。在碱性条件下，原位生成的氧阴离子对A5的中位碳原子发起分子内亲核进攻，得到螺环化产物。在丙酮-d6中A5溶液加入NaOH（1.0 M）后，羟甲基的亚甲基质子（H*）从4.60 ppm低场位移至5.38 ppm，而所有BODIPY芳香质子均向高场位移。这表明分子内螺环化显著破坏BODIPY发色团结构，消除其特有的去屏蔽影响。加入NaOH使A5的NMR颜色从深蓝色变为近无色。
酸碱滴定显示光谱特征发生变化，进一步证实了分子内螺环化。对于A5，pH升高导致原始吸收峰（λabs max = 632 nm）和发射峰（λem max = 655 nm）减弱并最终消失。表明BODIPY的π共轭体系遭到严重破坏，A5溶液颜色从青色变为无色，直观证明分子内螺环化的形成。根据吸收光谱测定，A5的pKa为6.3。具有α-1-甲基-4-乙烯基吡啶取代的A8和A6在螺环化后表现出明显不同的行为：它们的λabs max蓝移至～460 nm，荧光显著猝灭，溶液从青色变为黄色而非无色。可能是因为被破坏的BODIPY核的吡啶受体单元与吡咯供体单元之间形成有助于染料吸收的供体-π-受体结构。TD-DFT计算表明，A8-F和A8-Closed的计算吸收光谱具有良好的一致性。进一步证实了A8-Closed中存在D-π-A结构，该结构形成于吡啶鎓（受体）和BODIPY核心的吡咯单元（供体）之间。A8-Closed和A8的计算光谱也与其实验对应物吻合良好，证实了分子内螺环化的形成。染料系列A1-A8在较高pH条件下均表现出吸收和发射带的消失，其pKa值跨度较大（2.8-12.0）。值得注意的是，通过分子修饰可以轻松调节pKa。给电子α-芳基乙烯基取代基降低了BODIPY核的亲电性，阻碍分子内螺环化，从而提高pKa。例如，带有α-4-甲氧基苯基乙烯基的A1的pKa为10.9，而带有α-苯基乙烯基的A2的pKa为9.5。相反，对于带有吸电子α-芳基乙烯基取代基的染料（A3-A6，pKa7.9-2.8），吸电子能力增强。如较高的Hammett σp值和较低的最高占据分子轨道能级所示导致pKa值系统性降低。这两个参数均与pKa的降低呈强线性相关性（Pearson相关系数r≥0.95）。
受内消旋-(2-(羟甲基)苯基)取代的BODIPY（A系列）广泛可调的pKa特性启发，将羟甲基转化为羧酸，以将工作扩展到螺环BODIPY的开发。按照参考文献75的方法，合成了关键前体——内消旋-(2-羧基苯基)取代的BODIPY。随后，b分别与NCS（N-氯代琥珀酰亚胺）和TCCA（三氯异氰尿酸）反应，得到关键中间体b-2Cl和b-4Cl。由于内消旋-(2-羧基苯基)取代的BODIPY与Knoevenagel缩合反应不相容，采用Suzuki偶联在BODIPY的α位引入芳基。该方法在扩展BODIPY核心π共轭平面的同时增强了分子可修饰性，从而合成了具有多样电子效应的B系列衍生物。B系列染料表现出高亮度（ФFL•ε最高达64639 M-1cm-1，）和良好分子内螺环化能力。以B9为例，增加pH值导致其原有吸收峰（λabs max =552 nm）和发射峰（λem max =584 nm）显著消失。同时，B9的颜色从粉色褪为无色，其pKa经计算为4.2。在较高pH条件下，BODIPY核心受到严重破坏。B9经历了10次酸碱循环（pH~2.6↔~5.8）均未观察到变化，表明羧酸介导的开环/闭环过程具有优异的可逆性。B系列BODIPY的pKa值也可通过修饰取代基的电子效应进行精确调控。与A系列类似，吸电子α-芳基显著降低了pKa值。例如，α-4-（三氟甲基）苯基取代的B3的pKa值为3.0，而α-苯基取代的B1的pKa值为5.2。pKa值的降低与α-芳基的缺电子性之间存在明显的线性相关性，可用Hammett σp参数（皮尔逊相关系数r=-0.99）和HOMO能级（皮尔逊相关系数r=0.80）量化。此外，通过简单的GC-O基态DFT计算可有效预测BODIPY的pKa值。在B系列中，β-氯化也能有效降低pKa值。例如，B6（β-氯化）的pKa值为1.8，较非氯化的B9（pKa=4.3）显著降低。值得注意的是，B7和B8的pKa值无法确定，尤其是B7，无pH响应性。与其他衍生物相比，B7和B8的GC-O值更低，甚至为负值（B7：-0.06 eV；B8：0.10 eV），表明在基态条件下，其自发开环/闭环的热力学驱动力不足，可能解释了它们对酸碱刺激不敏感的现象。
利用商业化细胞器示踪剂进行的共定位实验证实了A8的线粒体靶向性和B9的溶酶体靶向性，在散点强度图中分别获得了0.95（罗丹明123）和0.96（LysoTracker Green DND-26）的高皮尔逊相关系数。CCK-8测定表明，两种探针在成像浓度（1.0 µM）下均具有可忽略的细胞毒性。根据文献报道的方法，将U-87 MG和HeLa细胞与含有10.0 µM尼日利亚菌素、不同pH值的PBS缓冲液共同孵育15分钟，以平衡细胞内pH。A8和B9的荧光强度均随pH值升高而降低，表明它们对细胞内pH波动具有响应性。使用不含任何成像增强缓冲液的标准DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）完全培养基，A8通过SMLM成功重建了活U-87 MG细胞中线粒体扭曲的毛毛虫状形态。SMLM图像显示，线粒体的FWHM约为159 nm，显著窄于约641 nm的衍射极限宽度，实现了比传统宽场荧光显微镜更高的分辨率。然而，商业SMLM探针MitoTracker Red在无添加剂条件下未能重建线粒体结构。A8在线粒体上的定位密度达到1665 localizations µm−2，对应49 nm的奈奎斯特分辨率极限。开关中检测到的A8平均光子数为773±121，定位精度为28.3±3.0 nm。使用3D-STORM模式仅需12 s即可完成线粒体的全3D重建（2 ms/帧，6000帧）。此外，我们还利用SMLM成像分析了UA诱导的线粒体自噬和肿胀过程。经50.0 µM UA处理3 h后，定量分析显示线粒体长度减少0.70倍（3.2→2.3 µm），宽度增加1.2倍（181→229 nm）固定在盖玻片上的A8在PBS缓冲液中随着pH值降低显示出光子计数增加，这与已知的罗丹明自闪烁行为一致。A8的光子爆发计数随着UA处理时间的延长而增加，这可能表明线粒体酸化逐渐加剧，与线粒体自噬中酸性溶酶体的吞噬作用相关。这些结果共同证实UA能有效触发线粒体自噬，导致线粒体功能障碍和酸化。
另一方面，B9在标准DMEM完全培养基中成功实现了活HeLa细胞溶酶体的时空超分辨成像，且未使用任何成像增强缓冲液。单分子定位显微镜（SMLM）成像显示，溶酶体的半峰全宽（FWHM）约为84 nm（ROI-1），而传统宽场荧光成像下约为408 nm，表明基于B9的SMLM成像分辨率显著提高。即使使用32 W cm-2的超低功率密度激光（561 nm激光，通常>500 W cm-2），B9每个开关事件的平均光子数仍高达1430±218。B9实现了4911 localizations µm−2的优异溶酶体标记密度，对应26 nm的奈奎斯特分辨率极限。图像清晰显示了单个溶酶体的动态变化，包括运动轨迹、速度、溶酶体间接触和空间分布。溶酶体在细胞内形成多个簇：ROI-2包含细胞核周围代表性的核周簇，而ROI-3～5包含细胞边缘附近代表性的外周簇。显然，ROI-2中的核周溶酶体分散性良好，运动轨迹较短且变化最小，而ROI-3～5中的外周溶酶体则更集中，轨迹更长且变化性更大。在正常细胞中，核周溶酶体（135±43 nm）显著大于外周溶酶体（110±41 nm），这可能是由于微管组织中心（MTOC）附近频繁发生融合所致。此外，观察到多种溶酶体运动和相互作用模式，包括单个溶酶体进行长距离移动，移动距离达3.7 µm，速度为0.18 µm s-1（ROI-5）。还观察到两个溶酶体相互靠近、同步转向并一起离开（ROI-5）；三个溶酶体聚集（ROI-4），以及一些核周溶酶体保持静止（ROI-1）。这些观察结果有力地证明，B9作为一种自闪烁单分子定位显微镜探针，能有效分辨纳米级溶酶体运动的多样性和相互作用场景。只有超分辨率显微镜能够对溶酶体的大小、分布和内部酸度进行动态分析，直接支持溶酶体疾病的诊断。然而，溶酶体的纳米级尺寸和高度动态特性仍然是重大挑战。利用基于B9的SMLM平台，量化了生理/病理条件下溶酶体分布和动力学的显著变化：正常、饥饿、细胞分裂、碱化、凋亡和酸化。具体而言，在饥饿、NH4Cl诱导的碱化和CCCP诱导的细胞凋亡（3-氯羰基氰基苯腙）过程中，溶酶体在核周聚集；而在CH3COONa诱导的酸化和细胞分裂前，溶酶体则向周边分散。此外，与未处理细胞相比，四种病理/应激条件下溶酶体直径发生显著变化（140±47 nm，p<0.001）：碱化条件下溶酶体肿胀（201±39 nm），而饥饿（106±27 nm）、细胞凋亡（100±33 nm）和酸化（119±40 nm）条件下则发生萎缩。
结论
本文建立了一种通用的分子设计策略，以实现BODIPY骨架中的螺环化。通过将分子内亲核试剂的中位苯基羟甲基/羧基与吸电子α/β取代基相结合，增强了中位碳的亲电性，驱动碱触发的分子内螺环化。并解析了首个螺环BODIPY的单晶结构，明确证实了螺环化结构。引入具有可调电子特性的α-芳基/芳基乙烯基，构建了多样化的探针库，表现出广泛的pKa可调性（1.8~12.0），系统阐明了pKa-结构-活性关系。这些探针在开放状态下表现出优异的亮度，并能在低激光功率下对活细胞进行自闪烁超分辨成像，无需成像增强缓冲液，追踪了线粒体自噬过程中的动态pH下降，同时捕获纳米级溶酶体的运动性、相互作用模式、大小重新分布以及在多种病理条件下的酸度变化，包括饥饿、分裂、凋亡、碱化和酸化。
参考文献
A General Strategy to Develop Intramolecular Spirocyclic BoronDipyrromethene Fluorophores for Self-Blinking Super-Resolution Imaging, Huiquan Zuo, Yiran Liu, Long Wang, Ruotong Li, Xing Guo, Luying Guo, Heng Li, Maoguo Li, Xinfu Zhang, Lijuan Jiao, Yi Xiao, and Erhong Hao, Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e202518973. https://doi.org/10.1002/anie.202518973
