内容摘要
本研究引入了“代谢途径激活”与“近红外探针原位合成”相结合的方法，利用索拉非尼诱导的异种移植肿瘤中内源性·OH产生的生物催化特性，触发光不敏感“单体”的原位二聚化，特异性放大芬顿反应，实现肿瘤微环境驱动的“自下而上”精确合成近红外花菁，从而实现“零背景”荧光成像。我们的创新单体配备了可变长度的烷基链，可精确调节亲脂性和亚细胞器靶向性。该策略克服了组织穿透的限制，通过“零背景”效应显著增强了肿瘤与正常组织的荧光对比度。Cy420与索拉非尼的协同作用建立了一个闭环诊疗系统，实现了治疗过程中对·OH动态和肿瘤边缘的实时可视化，为手术中肿瘤的精准切除提供了导航。
单体的设计策略与合成
本研究基于先前关于费歇尔碱在光照下自由基二聚化的工作，但针对其光敏性和短波长发射的不足进行了改进。采用红移的苯并[cd]吲哚-2(1H)-酮骨架代替传统费歇尔碱，以构建近红外花青染料。该骨架具有阳离子利于膜靶向、含氮位点便于连接调节亲脂性的烷基链、以及疏水微环境激活荧光等优势。合成了光敏的费歇尔碱Cy419，并进一步设计和合成了在N位点引入不同长度烷基链（C2, C8, C18）的稳定两性离子单体Cy196、Cy280和Cy420。所有化合物均经过充分表征。在芬顿试剂（·OH）触发下，评估了单体的异质二聚化。发现Cy196在乙腈中转化为Cy3的产率最高，且该转化是完全的。通过添加电子捕获试剂和自由基捕获剂证实了反应涉及单电子转移和自由基过程。使用2位为乙基取代的对照单体Cy210无法产生Cy3，证明了2-甲基的关键作用。通过在苯胺溶液中捕获反应中间体M1，提出了·OH引发的级联氢原子提取和自由基促进的异相二聚化机制。
单体与Cy3的光物理及组装行为
单体Cy420在DMSO中最大吸收/发射峰为420/460纳米，非常稳定。其产物mCy849具有独特的近红外光学性质，最大吸收/发射峰在760/820纳米，适用于深组织成像。在水溶液中，Cy3形成J聚集体导致红移。Cy420具有最长的荧光寿命。光谱和色谱分析证实，添加·OH后Cy420成功转化为mCy849。透射电子显微镜和动态光散射分析表明，单体均形成球形纳米颗粒，其尺寸随烷基链增长而增大，与计算的clogP值趋势一致，证明疏水作用主导自组装。相应的Cy3染料则转变为均匀的矩形纳米结构，更强的疏水性精确控制了形貌。计算化学表明，随着单体共轭体系延长，HOMO-LUMO能隙减小，与吸收和发射的红移趋势一致。Cy420在生理环境中呈圆形纳米颗粒，加入牛血清白蛋白后，重组为尺寸更小的单分散方形纳米结构，同时表面电荷从正电荷反转为稳定的负电荷。这种BSA介导的尺寸减小和电荷反转有利于通过EPR效应实现肿瘤蓄积，并延长血液循环时间，是其卓越靶向和成像性能的结构基础。
Cy420对生物物种的光谱响应
在生理条件下对Cy420进行·OH浓度依赖性光谱滴定。随着·OH浓度增加，Cy420在760 nm处吸收增强，820 nm处荧光发射显著增强，表明生成了mCy849。其校准曲线线性良好，检测限低至176.12 nM，具备超灵敏定量痕量·OH的潜力。高通量成像证实Cy420对·OH具有高度特异性，且在模拟溶酶体的酸性环境下仍可行。关键优势在于，单体Cy420的发射峰（~460 nm）与产物mCy849的近红外发射峰（~820 nm）相距甚远，实现了高达360 nm的斯托克斯位移，能有效减少光谱串扰。mCy849的荧光强度比其单体Cy420高165倍。这种巨大的发射差异和强度变化共同证实了其“零背景”荧光成像能力。此外，mCy849因其紧密聚集的结构，对过量的·OH表现出优异的稳定性，避免了探针被进一步氧化降解，确保了成像的可靠性。
细胞内·OH在铁死亡中的检测与评估
细胞毒性实验表明单体具有优异的生物相容性。亚细胞器共定位成像证实，烷基链长度调控靶向性：乙基取代的Cy196/mCy401特异性靶向内质网；辛基取代的Cy280/mCy569主要定位于线粒体；十八烷基取代的Cy420/mCy849特异性富集于溶酶体。这种定位规律具有跨细胞系的通用性。在索拉非尼诱导的Huh7细胞铁死亡模型中，LDH释放量升高。使用Cy420评估时，观察到绿色荧光信号（单体）减弱，近红外荧光信号（mCy849）增强，且与溶酶体标记物高度共定位，证实了铁死亡过程中溶酶体内·OH的生成。使用铁死亡抑制剂可阻碍红色荧光信号的生成，进一步验证了该信号由铁死亡过程中的·OH触发。本研究利用不同烷基链单体，证实铁死亡可发生内质网、线粒体和溶酶体等多个亚细胞位点。
结论
我们利用了由单线态氧（·OH）引发的近红外三甲川花青（Cy3）染料原位合成策略，该策略是基于我们之前工作中对费歇尔碱在阳光照射下二聚反应的改进，单体对病理引发的·OH表现出极高的反应活性，从而生成近红外荧光发射，实现了对铁死亡中·OH水平的“零背景”荧光精确量化和评估。系统阐明了两性离子单体生成Cy3的通用性，并确定·OH为最佳催化试剂。通过捕获反应中间体验证了·OH催化的Cy3合成机制。通过苯胺实验确定为·OH促进的级联氢原子提取以及随后的异相二聚反应。利用单体对光不敏感的特性，设计并合成了系列烷基取代的两性离子单体。共聚焦成像显示烷基链长度对亚细胞定位具有调节作用。相比之下，十八烷基修饰的Cy420/mCy849通过所组装纳米结构的胞吞作用实现了溶酶体靶向。值得注意的是，在我们设计的单体辅助下，证实了铁死亡的亚细胞位点存在于内质网、线粒体和溶酶体。十八烷基链的引入使Cy420在生理环境中自组装成圆形纳米颗粒，并在牛血清白蛋白（BSA）的辅助下发生结构重塑形成方形纳米颗粒，从而通过增强渗透和滞留效应（EPR效应）赋予Cy420肿瘤蓄积能力。mCy849强大的亲脂性使其组装成矩形纳米颗粒，有效屏蔽荧光团免受进一步的·OH氧化，从而保持定量成像的准确性。体内实验利用索拉非尼诱导的异种移植瘤铁死亡，展示了Cy420在持续内源性羟基自由基激活下高效转化为mCy849的过程，Cy420出色的持久荧光性能为异种移植瘤定位提供了有效的实时成像参数，有助于近红外荧光导航下的精准肿瘤切除。这种协同策略实现了在索拉非尼诱导的铁死亡过程中，通过内源性羟基自由基触发单体二聚化，肿瘤微环境驱动的近红外花菁染料原位时空合成，实现了内源性羟基自由基的精确评估以及异种移植瘤的“零背景”荧光成像，为进一步的荧光引导肿瘤切除提供了新的精准治疗策略，以对抗耐药性和肿瘤手术治疗。
参考文献
Ferroptosis-Impelled NIR Cyanine Dyes in Situ Generation Enabled Zero-Background Fluorescence Imaging and Precise Surgical Tumor Excision, Xiunan Xie, Zhihao Lu, Yuerui Kong, Chenye Jin, Ziyan Sun, Xiaoling Yang, Zan Li,* Fengli Qu,* Weihong Tan. Angew. Chem. Int. Ed:, 2025, DOI: 10.1002/anie.202520221.
