内容提要
本研究基于 GGT 活性和线粒体粘度开发了一种双响应荧光探针 (CZ)。 利用 CZ，揭示了恶性转化过程的特征是 GGT 活性升高和线粒体粘度增加。氧化应激的反复促进会加速向早期HCC的转化，而氧化应激的抑制则有效抑制病变的发展。 本研究提供证据表明早期HCC癌前病变进展是一个可控过程，GGT活性和线粒体粘度可以作为监测肝脏癌前病变进展的指标。
实验结果与讨论
CZ 的 GGT 光学特性和粘度
最初评估了 CZ 对 GGT 的光谱响应。添加 GGT 后，观察到吸收从 350 nm 到 400 nm 的明显红移，表明与 GGT 反应形成了 CZ-OH。 CZ-OH被分离并通过HPLC和HRMS验证。 首先，我们进行 HPLC 分析以确认 CZ-OH 的产生（甲醇：水 = 8：2，v：v，14 分钟）。 纯化的 CZ 和 CZ-OH 记录的保留时间分别为 2.0 和 6.6 分钟。 CZ 与 GGT 反应后，6.6 分钟的峰显着增强，而 2.0 分钟的峰下降，表明 CZ-OH 是通过 GGT 水解 CZ 产生的。 质谱分析进一步证实了这一过程，在与 GGT 一起孵育后，质谱分析显示了 m/z 737.3673 处的新峰 (CZOH)。 滴定实验证明了 CZ 检测 GGT 活性的定量能力。 因此，随着 GGT 活性的增加，CZ 在 456 nm 处的荧光强度逐渐增强（浓度范围：1–90 U L−1）。 值得注意的是，线性方程为 y = 6353x + 70 684，GGT 浓度 (0–50 U L−1) 和 CZ (F.I. at 456 nm) 具有良好的线性 (R2 = 0.9958)。 因此，CZ的检测限确定为0.211 U L−1 (3σ/k)，为准确测量肝脏癌前病变中的GGT水平提供了足够的灵敏度。 此外，CZ 响应 GGT 活性 (50 U L−1) 的时间依赖性荧光强度在 60 分钟内达到最大值，确立 60 分钟作为 GGT 测定的最佳潜伏期。 此外，根据 Michaelis-Menten 方程，测得 CZ 对 GGT 的米氏常数为 14.26 µm，表明 CZ 可以以强亲和力检测 GGT。 然而，同时添加 GGT 和阿西维辛（一种 GGT 抑制剂）并没有导致蓝色荧光增强，进一步验证了 CZ 与 GGT 的反应。 CZ 对 GGT 的特异性经过严格验证，与其他 22 种潜在干扰物相比，仅在含有 GGT 的系统中观察到荧光增强（F.I.at 456 nm）。 这种选择性特征证实 CZ 可以在复杂的生理环境中用作精密生物传感器。评估了 CZ 对粘度的光谱响应。 当溶解在甘油中时，观察到 CZ 的吸收从 400 nm 到 660 nm 显着增强，表明分子旋转在甘油的高粘度介质中受到限制，从而增加了平面共轭程度。 在一系列 PBS-甘油混合物中研究了 CZ 对不同粘度的荧光响应，以确定 CZ 是否可以选择性地响应粘度。 随着甘油含量的增加，CZ 的荧光逐渐增强。 值得注意的是，CZ 表现出粘度响应荧光增强（与 PBS 溶液相比，99% 甘油中的发射增加了 234 倍，λex = 640 nm），证明了其对粘度变化高度敏感的能力。 Förster–Hoffmann 方程（Log F = k Log η + C，k：染料特定常数；C：浓度/温度系数）用于控制 CZ 的粘度-荧光相关性。 CZ 的荧光（F.I.at 720 nm）在 0.89−945 cP 范围内与粘度（y = 0.85x+2.85，R2 = 0.9962）呈线性相关，涵盖生理和病理细胞内粘度范围。 同时，CZ在粘度通道中的荧光强度随着温度的降低而增加，并表现出良好的可逆性，进一步表明CZ对粘度的敏感性。 此外，CZ 具有高粘度选择性，在其他 22 种生物干扰物中显示出可忽略不计的荧光变化（F.I. at 720 nm）。 溶剂极性筛选显示，与不同极性水平的对照相比，粘性甘油 (η = 945 cP) 中 CZ 的荧光放大，确认了微环境特异性响应。 此外，还研究了 CZ 在生理 pH 范围内对 GGT 和粘度的 pH 不敏感性。 GGT 和粘度通道的荧光强度在 pH 7.0−8.0 范围内几乎没有变化，涵盖了生理条件。 我们进一步测试了几种常见ROS对荧光探针CZ稳定性的影响。 在GGT通道中，ROS对CZ荧光强度的影响可以忽略不计。 添加GGT后，在ROS存在的情况下，CZ的荧光强度仍显着增强，但略低于PBS组。 同时，在ROS存在下，高粘度环境下CZ粘度通道的荧光强度也表现出明显增强，略低于PBS组，但不影响其在ROS存在下对粘度的监测。 此外，在 11 种常见酶存在下检查了 CZ 的稳定性。 结果表明，CZ 仅在 GGT 存在的情况下在 400 nm 处表现出新的吸收峰。
GGT 和线粒体粘度的细胞成像
CZ 的双重响应能力在体外得到验证，我们进一步评估了其对 GGT 和线粒体粘度同时成像的细胞功效。 使用标准 MTT（甲基噻唑基二苯基溴化四唑）测定法全面评估了 CZ 对细胞的潜在细胞毒性。 CZ 表现出卓越的生物相容性（24 小时时细胞活力 >90%），满足活细胞追踪的细胞毒性安全阈值和成像适用性标准。CZ 用于定量评估各种细胞类型中的 GGT 活性和线粒体粘度。肿瘤细胞（HepG2、Hela）中GGT和粘度通道的荧光强度比非肿瘤细胞（L929、L02）高3.8倍和2.9倍。 此外，在60分钟的连续孵育期内，HepG2细胞在GGT通道和粘度通道中的荧光强度始终高于L02细胞。 上述结果清楚地表明癌细胞中 GGT 和粘度水平升高。 值得注意的是，LX-2细胞GGT通道的荧光强度也显着高于L02细胞的3.5倍，但其粘度通道与L02细胞相比没有显着差异。 这些结果与之前的文献报道一致。 此外，为了验证对细胞内GGT和线粒体粘度水平的调节作用，用外源物质刺激L02细胞，并通过CZ监测GGT和线粒体通道的荧光强度。当用NaBu（丁酸钠，内源性GGT诱导剂）刺激时，与对照组相比，L02细胞的GGT通道中显示出显着的荧光增强（增加2.0倍）。 同时，粘度通道中的荧光强度也增加了1.9倍，表明NaBu不仅可以上调GGT的表达，还可以增加L02细胞的线粒体粘度。 然而，与 Acivicin（GGT 抑制剂）和 NaBu 一起孵育后，与对照组相比，在 GGT 和粘度通道中观察到的荧光强度变化可以忽略不计。 这表明Acivicin抑制了NaBu刺激的GGT上调。 同时，当L02细胞用Nys（制霉菌素，一种粘度诱导剂）处理时，粘度通道显示出显着的荧光增强（1.7倍），而GGT通道的荧光强度几乎保持不变。 随后，与NaBu和Nys一起孵育后，L02细胞在GGT和粘度通道中的荧光强度同时增强了2.6倍和2.2倍。 因此，这些结果清楚地表明 CZ 可以作为视觉监测和调节细胞内 GGT 和线粒体粘度的工具。通过共定位实验验证了CZ的线粒体定位能力。 CZ 与商业线粒体染料的共定位系数为 0.92，而与商业溶酶体染料的共定位系数仅为 0.69。 这表明CZ具有优异的线粒体定位能力。 为了验证 GGT 和线粒体粘度的精确信号，我们首先评估了两个通道（GGT/粘度）之间的 CZ 光谱串扰。 选择 GGT 通道和粘度通道，然后利用通道 3 消除光谱串扰。 GGT 通道和粘度通道分别对应于 HepG2 细胞的内源性 GGT 和线粒体粘度水平。 通道 3 中可忽略不计的绿色荧光表明 GGT 和粘度通道之间不存在光谱串扰，从而证实了探针同时定量 GGT 和线粒体粘度的特异性。 为了进一步模拟肝脏癌前病变的真实环境，共培养了三种关键细胞L02、LX-2和HepG2，并采用CZ来跟踪该过程。L02细胞中GGT通道的荧光弱于LX-2和HepG2细胞，而HepG2细胞中粘度通道的荧光强于L02和LX-2细胞。 同时，LX-2和HepG2细胞中GGT通道的相对荧光强度分别比L02细胞高3.1倍和3.5倍，而HepG2细胞中粘度通道与L02和LX-2细胞相比分别增加2.2倍和2.3倍。 综上所述，上述结果表明，L02细胞、LX-2细胞和HepG2细胞可以通过GGT活性和线粒体粘度水平来区分，使得CZ适合进一步研究这三类细胞在肝脏癌前病变进展过程中GGT和线粒体粘度水平的变化。
细胞共培养系统的动态可视化和调控
越来越多的证据强调了慢性氧化损伤在肝脏癌前病变中的关键作用。 具体而言，氧化还原失衡触发的 HSC 激活导致致癌细胞因子的旁分泌分泌，直接协调起始 HCC 细胞的增殖和迁移表型。 我们的目的是利用CZ监测这一过程中GGT活性和线粒体粘度的变化。根据已报道的细胞共培养研究，构建了包含L02、LX-2和HepG2细胞的细胞共培养系统，并利用CZ实现了双参数实时监测。 在四组细胞共培养系统（L02LX2、LX2-HepG2、L02-HepG2 和 L02-LX2-HepG2）中，分别由 Erastin（Xc-系统抑制剂，诱导谷胱甘肽消耗和抗氧化防御系统崩溃）诱导氧化应激。 结果表明，所有共培养系统在 Erastin 处理后 6 至 48 小时内均表现出 GGT 活性和线粒体粘度短暂增加，其中三细胞共培养系统 (L02-LX-2-HepG2) 在 36 小时达到峰值，对应于荧光强度分别升高 3.4 倍（GGT 通道）和 2.9 倍（粘度通道）。此外，CCK-8（细胞计数试剂盒-8）检测显示，48小时时，三细胞系统的细胞活力显着增强49％，而其他系统的细胞活力增加不到15％，表明HCC细胞发生显着增殖。 划痕实验进一步证实，36小时时三细胞系统的迁移率是其他系统的两倍（伤口闭合率分别为36% vs 18%–19%），表明L02和LX-2细胞促进了HCC细胞的迁移。 这些结果表明，在氧化应激下，LX-2细胞通过与L02细胞协同作用驱动HCC细胞增殖和迁移，并伴随GGT活性和线粒体粘度的显着变化。L02、LX-2 和 HepG2 细胞直接接触共培养，模拟肝脏癌前微环境。 进一步的实验结果表明，重复Erastin刺激（0、60和120小时）会引起GGT和线粒体粘度的波动，最终导致GGT和粘度通道的荧光强度分别增强2.8倍和2.7倍。 鉴于氧化应激的促进作用，NAC（N-乙酰半胱氨酸）被用作ROS清除剂来抑制肝细胞癌前体的进展。值得注意的是，与 G1 相比，NAC 处理（G2）显着抑制了其 GGT 活性和线粒体粘度的升高，荧光强度仅分别增加了 1.4 倍和 1.5 倍。 为了进一步阐明调控过程，我们进行了 CCK-8 测定和划痕实验。 从表1可以清楚地看出，促进氧化应激最终导致HepG2细胞的增殖率增加81％和迁移率增加67％。 而当抑制氧化应激时，HepG2细胞的增殖率和迁移率仅分别增加了48%和46%。 同时，ROS测定显示G1中的ROS水平从398 IUmL−1增加到609 IUmL−1，而NAC通过清除ROS来减轻氧化应激，这导致G2中的ROS水平从609下降到477 IUmL−1。 此外，促进氧化应激（G1）最终显着诱导促癌因子如α-SMA、COL1A1、MMP2、VEGFA和GGT的上调。
皮下肿瘤小鼠的动态可视化和调节
鉴于 CZ 在细胞水平监测 GGT 活性和线粒体粘度方面具有强大的可视化能力，我们进一步将 CZ 应用于皮下荷瘤小鼠。将L02、LX-2和HepG2细胞制备成细胞悬液，然后皮下植入BALB/C裸鼠。通过在皮下肿瘤内诱导高水平的氧化还原微环境，刺激HSCs的激活，从而促进HCC细胞的增殖和迁移，同时动态监测线粒体粘度和肿瘤生长的变化，并应用抗氧化调节。我们观察了皮下肿瘤内 CZ 荧光的时间变化。粘度通道中的荧光强度在2 小时时达到约三倍的峰值增强，随后在 12 小时时逐渐下降至基线水平。 随后的实验包括在瘤内注射 CZ 后 2 小时收集荧光数据，并每 12 小时重复注射和数据收集。 实验数据显示，在肿瘤生长过程中，GGT 活性和线粒体粘度显着上调。 在Erastin治疗组（G1）中，粘度通道中的荧光强度在36、96和168小时出现波动峰值（分别增加1.8、1.7和2.0倍），96小时后肿瘤生长加速（平均肿瘤体积达到82.7 mm3，从0到168小时增加11.5倍）。相反，NAC治疗组（G2）在120小时后荧光强度达到平台（增加1.0倍），平均肿瘤体积为34.2mm3，从0到168小时增加4.7倍。 由于GGT通道的发射波长短，使用体内成像不可能从GGT通道获得信号。因此，从小鼠身上切除肿瘤进行离体荧光成像。与G1组相比，G2组GGT/粘度通道的荧光强度分别降低了53%/74%，与体内成像结果一致。 值得注意的是，CZ对皮下肿瘤冰冻切片的荧光成像与IVIS（体内成像系统）荧光数据高度一致：与G2组相比，G1组在GGT和粘度通道中的荧光强度分别高出1.6和2.0倍，表明CZ能够在氧化应激调节肿瘤生长过程中动态监测GGT活性和线粒体粘度。
进一步的机理验证证实了CZ动态监测肝脏癌前病变的可靠性。 G1组表现出α-SMA、COL1A1、MMP2、VEGFA和GGT显着上调，表明HSC活化、胶原沉积以及HepG2细胞增殖、迁移和血管生成增强。 相比之下，NAC 治疗后 G2 组中这些标记物下调。 H&E（苏木精和伊红）染色进一步证实G1组纤维化结构丰富，癌细胞生长良好，而G2组细胞部分坏死，纤维化结构较少，癌细胞生长较差。
结论
为了满足肝癌前病变进展过程中同时监测GGT活性和线粒体粘度的迫切需求，我们设计了一种双响应荧光探针（CZ），通过集成香豆素（GGT通道：λex/em = 405/456 nm）和半花青响应单元（粘度通道：λex/em = 640/720 nm）来精确监测GGT/粘度，从而消除光谱串扰干扰和 实现对两个参数的精确监测。 CZ具有两个独立的检测通道，灵敏度高（GGT检测限：0.211 U L−1；粘度通道荧光强度增强234倍），特异性好。利用CZ，我们实现了共培养细胞、皮下荷瘤小鼠和小鼠HCC模型中HCC癌前病变进展的实时监测。 在共培养细胞系统（L02-LX-2-HepG2）中，重复的氧化应激诱导HepG2细胞中GGT中的CZ荧光强度和粘度通道中的CZ荧光强度增强2.8倍和2.7倍，从而驱动HepG2细胞的增殖和迁移。这些效应被抗氧化剂 NAC显着抑制，NAC分别降低了 GGT 和粘度通道的荧光强度，并分别抑制了细胞增殖和迁移率。在皮下荷瘤小鼠模型中，重复的氧化应激使肿瘤体积增加11.5倍，GGT活性和线粒体粘度分别增加1.6倍和2.0倍。 NAC 治疗将肿瘤生长限制为 4.7 倍，并将 GGT 和粘度通道的荧光强度分别降低 53% 和 74%。在小鼠HCC模型中，当粘性通道荧光强度增强1.7倍以上时，肝脏癌前病变进入恶变阶段，而早期HCC发展过程中粘性通道荧光强度增强2.8倍。虽然及时的抗氧化应激干预可以抑制恶性转化过程，但粘度通道的荧光强度仅增强了1.8倍。这一发现为肝脏癌前病变提供了潜在的定量诊断标准（粘度通道荧光强度>基线值的1.7倍）。
参考文献
Feasibility Study on Visual Monitoring and Regulation of Liver Precancerous Lesions, Zichun Zhou, Feng Ouyang, Minzhe Wang, Yongqian Xu, Hongjuan Li, Ping Hou, Juan Luo, and Shiguo Sun，Advanced Healthcare Materials, 2025; 0:e02325，https://doi.org/10.1002/adhm.202502325.
