内容提要
本研究设计一种基于近红外BODIPY的炎症激活光敏剂(Lyso710A)并将其加载到巨噬细胞中。这些“武装”的巨噬细胞被转移到被感染的宿主体内，捕捉细菌，并通过血液循环将它们运送到皮肤表面，在那里阳光可以穿透。在捕获细菌后，Lyso710A的光动力效应被巨噬细胞的内源性次氯酸(HClO)开启。当这些巨噬细胞到达表皮时，在暴露于阳光下时，被激活的光敏剂的光动力作用将细菌消灭。该策略在两种全身性细菌感染的动物模型(小鼠和兔子)中显示出有希望的治疗效果，在动物中使用0.14 mg kg−1的低光敏剂剂量。
实验结果与讨论
分子设计与光物理性质研究
我们首先提出了一种优雅设计的溶酶体靶向近红外(NIR)光敏剂(Lyso710A)，它具有稳定的溶酶体靶向能力，对HClO具有特异性响应，并且在HClO激活后具有高光动力效应。将两个吩噻嗪偶联到一个BODIPY核上，将其吸收波长扩展到NIR区。在BODIPY核心的2,6位置引入两个碘原子，以提高其通过重原子效应敏化氧的能力。然而，在这个π-conjugated体系中，吩噻嗪基团作为BOD-IPY核心的电子供体，赋予了显著的分子内电荷转移(ICT)效应。结果表明，Lyso710A几乎没有光动力效力。然而，当巨噬细胞释放内源性HClO氧化s时，它被激活(产生强烈的光动力效应)。此外，1O2是一种高活性/破坏性物质，半衰期短(≈0.6 μs)，扩散半径约为20 nm。为了绘制光敏剂和细菌之间的距离，将一个叔胺片段接枝到每个吩噻嗪上，以使溶酶体具有靶向能力。此外，还引入了短PEG链以提高其生物相容性。总的来说，Lyso710A具有三个结构特征:1)特定的次氯酸反应，2)稳定的溶酶体定位，3)高激活后的光动力效力。我们通过Lyso710A培养巨噬细胞构建最终的A-RAWs。这些武装巨噬细胞处于“待机”模式，没有光动力作用。它们随时准备被注射到被感染的宿主体内，并在“待机”模式下保持活力。光动力效应在细菌摄取时被激活。
在获得Lyso710A后，我们测定了Lyso710A对HClO的光物理性质和光动力效率。Lyso710A在350 ~ 800 nm处表现出强烈的吸收(在713 nm处消光系数为84 450 M−1·cm−1)，覆盖了相当大的光谱区域。这种广泛的吸收光谱表明Lyso710A在吸收太阳光用于PDT方面的优势。由于从吩噻嗪类药物到BODIPY核心的ICT效应，Lyso710A没有可检测到的发射加入HClO后，吸收蓝最大值从713 nm移至691 nm(691 nm处消光系数为84 450 M−1·cm−1)，在715 nm处出现荧光发射峰(荧光量子产率为0.4%)。
然后我们验证了Lyso710A对HClO的响应率和选择性。加入100 μm的HClO后，荧光强度(715 nm处)的动力学曲线表明，氧化可在8 s内完成。比较了Lyso710A对HClO的选择性与其他过量活性氧和活性氮(ROS/RNS, 1.5mm)。当加入其他ROSs和RNSs时，715 nm处的发射量略有增加。该结果表明，Lyso710A对HClO具有高度选择性，保证了巨噬细胞激活前的稳定待机状态和最小的光动力效应。我们使用DPBF作为1O2指示剂进一步评估了Lyso710A响应HClO氧化的光动力效率。在0.1% Triton X-100/PBS中，Lyso710A不产生1O2 (1O2量子产率无法检测)。相比之下，Lyso710A氧化后在PBS (pH = 7.4)中的1O2量子产率计算为0.42。这一结果表明HClO是Lyso710A光动力学效应的有效触发因素。
为了验证HClO诱导的硫醚氧化，我们分别在细菌感染期间使用过量的HClO和在活的RAWs中模拟Lyso710A的氧化。然后，我们通过液相色谱(HPLC法)和高分辨率质谱(HRMS)对氧化产物进行了表征。Lyso710A的HPLC保留时间为34.02min，氧化产物的保留时间为24.07 min和25.03 min。HPLC产物通过HRMS进行表征。如Lyso710A的m/z值为802.2205([(m +2H)/2]1+)，氧化产物的m/z值分别为826.2149 ([(m +2H)/2]1+)和834.2125 ([(m +2H)/2]1+)，对应于两个吩噻嗪基团(亚砜)的单氧化和两个吩噻嗪基团(砜)的双氧化。HPLC和HRMS结果表明，硫醚成功氧化为亚砜和砜。我们进一步用MRSA细菌模拟活RAWs中Lyso710A的活化(氧化)，并从细胞裂解液中收集氧化产物进行表征。HRMS显示m/z ([(m +2H)/2]1+)分别为810.2195(单亚砜)、818.2175(双亚砜)、826.2147(单砜)和834.2127(双砜)，对应Lyso710A中吩噻嗪基团的四个氧化水平。这一结果表明，细菌侵染期间的氧化应激使Lyso710A氧化成亚砜和/或砜形式。
A-RAWs的耐久性、光动力效率及其对健康细胞的光毒性
Lyso710A的开启机制延长了A-RAWs的寿命，使其保持待机状态，直到它们捕获细菌，这是使用较低功率但更长时间的光照射(如日光浴)进行有效光疗的关键特性，允许在一次给药后进行多次光疗。并最大限度地减少对附近健康细胞的损害。根据以上光谱结果，Lyso710A在氧化前保持关闭状态，表现为无有或没有光照射的光毒性。因此，A-RAWs可以在宿主体内保持有效(待机模式)数天，这是一个很长的窗口期，可以捕获细菌并进行光疗。我们仔细评估了待机模式下(在捕获细菌之前)A-RAWs对邻近健康细胞的稳定性和光毒性。我们首先通过MTT法和活/死细胞共染色法证实了光照和不光照下A-RAWs的细胞活力。新鲜制备的A-RAWs(命名为A-RAWs /fresh)在Lyso710A浓度为20 μM的条件下处理后，其活力高于93.43%。光照后染色的A-RAWs存活率高于93.06%，表明A-RAWs在光照下是稳定的。我们在1毫米的肉覆盖下进行了相同的MTT试验，以模拟覆盖毛细血管的表皮。光照组和未光照组的A-RAWs存活率分别为94.73%和94.00%。我们在制备后72 h使用A-RAWs进一步进行了相同的实验(命名为A-RAWs/prepared);制备的A-RAWs(有或没有肉覆盖)在光照条件下的存活率均高于95.00% (20 μm组)。结果显示，光辐射(20 μm组)的存活率(有或没有肉覆盖)高于92.61%。我们也证实了细胞的活力使用活/死细胞共染色法。A-RAWs/fresh在光照射(模拟阳光，70 mW cm−2,40 min)后，钙黄素- am通道中显示出强烈的荧光，而PI通道中没有荧光，这表明在关闭状态下的Lyso710A对细胞的毒性检测不到。这些结果表明，Lyso710A加载过程和随后的光照不会损害巨噬细胞的活力，使A-RAWs保持细胞完整性并保持待机状态，无论阳光照射如何。
On-Mode下A-RAWs的靶向特异性和光动力效率
我们证实了Lyso710A对溶酶体的靶向特异性。Lyso710A与DND-26的共定位成像(Pearson相关系数为0.95)显示Lyso710A对溶酶体的靶向特异性。这种靶向性有利于1O2对细菌的有效应用。我们通过比较捕获细菌前后的荧光强度和产生ROS的能力来评估A-RAWs对细菌的反应。A-RAWs在被细菌处理前没有荧光，但在捕获细菌后发出强烈的红色荧光。它证实了A-RAWs在捕获细菌时进入开启状态。同时，使用DCFH-DA监测A-RAWs内ROS的生成。MRSA处理后，对照组(不含Lyso710A的RAWs)在光照(模拟阳光，70 mW cm−2,40 min)或不光照下均未观察到绿色荧光，说明各组未产生ROS。A-RAWs经MRSA处理后，光照射后可见强烈的绿色荧光，表明Lyso710A在捕获细菌后被打开，在光照射下产生1O2。我们进一步利用A-RAWs对MRSA的吞噬过程进行了荧光成像，以证明它们对细菌的反应。MRSA(伪绿色，由膜跟踪器Mem-SQAC染色)在第12分钟开始被A-RAWs带入细胞质。随着核内体的成熟，氧化的Lyso710A(红色)的荧光在第34分钟逐渐增加。最后，MRSA在第63分钟被转运到溶酶体中。正如细菌发出的绿色荧光和氧化Lyso710A发出的红色荧光所显示的那样。这种动态可视化证实了我们的策略和A-RAWs对细菌的反应的可行性。
我们在体外测试了A-RAWs的抗菌效率。我们用MRSA处理A-RAWs 0.5 h，使细菌能够吞噬。然后，我们使用硫酸庆大霉素(100 μg mL−1)去除培养基中的游离细菌(1小时)。接下来，我们用模拟阳光(70 mW cm−2,40分钟)处理这些已经吸收细菌的A-RAWs。这些A-RAWs在光疗后被裂解并用于培养细菌菌落。根据菌落计数，实验组(A-RAWs光/0 mm)的MRSA被消除。我们使用1 mm鸡肉模拟覆盖毛细血管的表皮，进行了相同的抗菌实验。MRSA也被完全去除(A-RAWs光/1 mm)。相比之下，RAW组(黑暗和光明)的菌落形成单位(CFU)至少为3.43 ×10-6。A-RAWs暗组CFU为2.91 ×10-6。为了证明A-RAWs的耐久性和抗菌时间窗，我们使用A-RAWs/制备进行了相同的体外实验。两个测试组(A-RAWs光/0 mm和A-RAWs光/1 mm)也消除了MRSA。这些结果表明，A-RAWs支持长达72小时的延长治疗窗口，并表现出高抗菌效率，提供超过1毫米的覆盖范围。
通过日光浴治疗小鼠和家兔模型的全身性细菌感染
鉴于体外实验结果良好，我们最终利用A-RAWs治疗小鼠和家兔败血症模型皮下给药。败血症是一种危及生命的疾病，由严重的全身感染引起A-RAWs有望补充免疫系统，跟踪和捕获细菌，并通过使用最小光敏剂的PDT消除细菌。据我们所知，这是首个通过沐浴在阳光下进行光动力治疗深层组织感染的报道。
结论
在这项工作中，我们提出了一种基于细胞的策略，通过沐浴在阳光下使细菌感染的PDT成为可能。该策略利用了PDT的治疗效率和巨噬细胞的先天趋化性。溶so710a光动力效应的“开关”机制使我们的治疗具有高度的细菌特异性和对健康组织的安全性。在溶酶体中携带溶so710a的巨噬细胞就像聪明的猎人一样，能够将可激活的光敏剂(溶so710a)准确地传递给深层组织中的细菌，并通过血液将捕获的细菌自发地运输到表皮层，从而有效地消除阳光下的细菌。
参考文献
An Activable Photosensitizer for Sunshine-Driven Photodynamic Therapy Against Multiple-Antibiotic-Resistant Bacteria by Exploiting Macrophage Chemotaxis，Zehui Wang, Lai Wang, Lin Zhou, Yi Xiao,* and Xinfu Zhang，Adv. Mater. 2025, e08232，DOI: 10.1002/adma.202508232
