内容提要
本项目引入一个通用的“分析物诱导pKa可调”(AIPT)半蓝双锁定平台(pKa-RH)，用于体内肿瘤的精确成像。利用这一功能，分析物响应改变了识别单元的供电子能力，移动了探针的pKa，并能够同时检测酸度和其他生物标志物。为了验证pKa-RH的多功能性，我们设计了两个双锁定的探针pKa-CE(pKa=5.4)和pKa-Cys(pKa=4.9)，带有乙酰基(对于羧酸酯酶)和丙烯酸酯部分(对于半胱氨酸)的识别单元，它们被原位切割以释放pKa-RH3(pKa=6.6)，同时激活一个pH响应，引起强烈的荧光增强。这两种探针在肝细胞癌筛查和成像中表现出快速、特异和灵敏的反应以及肿瘤与正常组织的高比率。
实验结果与讨论
分析诱导的pKa可调半蓝双锁平台的合成及光物理性质
为了结合传统串联和平行双锁定探针的优点，我们在空间上不同的位置设计了两个响应位点，使得第二个响应取决于前一个分析物响应事件，从而合成了一个“分析物诱导的pKa可调”(AIPT)半花兰平台(记为pKa-RH)。pKa-RH平台具有光学可调位置(R1取代基)，这些染料中的氮原子起到质子陷阱的作用，R1基团的变化显著调节了它们对pH变化的敏感性。pKa-RH染料在580−610 nm处有明显的吸收峰，在630−680 nm处有明显的荧光发射峰。
为了验证AIPT策略的有效性，进行了系统的UV/Vis吸收和荧光光谱研究，发现这些分子在酸性条件下表现出长的吸收和发射峰，而在碱性条件下没有观察到这些特征。通过绘制荧光强度与pH的关系图，我们确定了这些染料的pKa值(pKa-RH1分别为8.5；pKa-RH2为7.1；pKa-RH3为6.6；pKa-RH4为5.7；pKa-CE为5.4；pKa-Cys为4.9)。值得注意的是，在这些染料中，pKa-RH3的pKa值为6.6，属于TME的范围，特别适合于肿瘤成像。相比之下，pKa-RH1和pKa-RH2由于其强给电子基而具有较高的pKa值，在生理条件下不能有效地区分肿瘤细胞和正常细胞。其他化合物，如pKaRH4，pKa-CE和pKa-Cys，具有较弱的R1基团的电子给体能力和较低的pKa值，在pH为6.5−6.9的TME中显示出可忽略的荧光信号。因此，这些染料的pKa值随着R1基团给电子能力的增加而增加，这为AIPT策略提供了一个可行的逻辑。为了进一步阐明潜在的机制，我们进行了密度泛函理论计算，精确地确定了染料分子的最高占据分子轨道(HOMO)和最低空分子轨道(LUMO)能级，并计算了静电势(ESP)。这些染料的HOMO和LUMO之间的带隙和分布与它们的荧光发射波长是一致的。随后，经过几何优化，红色区域代表高电子密度和低静电势的区域。同时，随着R1基团给电子能力的逐渐降低，作为敏感质子陷阱的氮原子的ESP(用黄色箭头表示)逐渐增加，相应的pKa值相应减少。最后，为了验证这些探针的pH敏感机理，我们测量了pKa-RH3在酸性和中性条件下的1H核磁共振波谱。在加入重氢盐酸(DCL)后，共轭芳香区的特征1H信号都从前场移动到了下场。这种脱除效应可以归因于异构化后荧光团吸电子能力的增强，证实了不同pH条件下异构化的质子化−去质子化机理。
基于pKa-RH的两个双锁定探头的光学响应
细胞内双锁定探针pKa-CE和pKa-Cys的荧光成像
受到双锁pKa-RH平台良好的体外性能的鼓舞，我们对肿瘤细胞进行了进一步的研究。成像前，用四甲基偶氮唑盐比色法检测pKa-RH的细胞毒作用。即使在pKa-RH浓度高达25μM的情况下，也没有观察到明显的损伤，表明了良好的生物相容性。此外，共聚焦成像实验表明，pKa-RH的红色荧光信号对溶酶体和线粒体具有靶向性和成像能力。随后，我们选择了pKa-CE来进一步研究双锁定探针区分肿瘤细胞和正常细胞的潜力。值得注意的是，与AML-12和HK-2细胞相比，该探针在HepG2和HeLa细胞中的荧光信号显著增加，显示出良好的肿瘤细胞和正常细胞的区分能力。同时，在用pKa-CE处理的细胞中，10min后迅速观察到明显的信号，40min时峰值强度增加了8.5倍，表明该探针可以实现快速和持续的成像。为了进一步阐明CE和pH肿瘤细胞生物标志物对信号的影响，最初使用三苯基膦(TPP；10μM)作为抑制CE活性的抑制剂，而使用5-氟尿嘧啶(5FU；20μM)上调CE活性。在引入TPP后，HepG-2细胞的荧光强度仅比AML-12细胞高1.6倍。相反，5-FU的应用显著增强了成像通道中的红色荧光信号，荧光强度比原始值增加了14.2倍。这些结果强调了pKa-CE可以通过内源性CE变异在肿瘤细胞中被有效地激活，为实时打开第一个“锁”提供了关键证据。当细胞基质中的CE活性被TPP抑制时，细胞与pKa-CE在含有黑素(10μM)的PBS中在不同的pH值下共同孵育。正如预期的那样，探针的荧光强度随着酸度的增加而增加；但在pH 6.5时，荧光信号仍然很弱。这表明，单靠pH变化不足以实现有效和精确的肿瘤监测所需的灵敏度和特异性，因为TME中的pH响应取决于CE的先前响应。随着CE浓度的增加，由于AIPT机制，探针的pKa值恢复到6.6，在pH 6.5下的荧光信号显示出32.5倍的显著增加。因此，双锁定探针pKa-CE可以通过AIPT机制实现高特异性的肿瘤细胞成像。
我们进一步探索了双锁定探针pKa-Cys在HepG2细胞中的成像能力。首先，与AML-12和HK-2细胞相比，pKa-Cys在HepG2和HeLa细胞中的荧光信号分别增加了16.1倍和13.6倍，显示出良好的区分肿瘤细胞和正常细胞的能力。在外源实验中，随着半胱氨酸浓度增加到100μM，HepG2细胞中的荧光信号显著增加19.2倍，而经N-乙酰半胱氨酸(NAC；500μM)和二硫苏糖醇(DTT；500μM)处理的HepG2细胞的荧光强度分别是AML-12细胞的24.9倍和24.8倍。相比之下，N-乙基马来酰亚胺(NEM；500μM)处理细胞40min，然后与pKa-半胱氨酸(10μM)孵育，细胞的红色荧光显著降低，进一步表明该探针可以灵敏地检测药物诱导的细胞内半胱氨酸浓度的变化，并有效地打开第一个“锁”。在含有黑素(10μM)的缓冲液中，加入不同pH值的pKa-半胱氨酸，NEM抑制细胞半胱氨酸的表达。正如预期的那样，随着pH值的升高，红色通道的荧光强度逐渐减弱，在pH 6.0~7.0之间没有观察到明显的荧光信号。这表明仅有pH响应不足以进行高保真成像。此外，随着DTT和NAC诱导的细胞内Cys浓度的增加，探针的pKa值通过AIPT策略恢复到6.6。这使得该探针能够在pH 6.5的环境中以双重响应的方式有效地对半胱氨酸和pH做出反应，导致HepG2细胞中的荧光信号比AML-12细胞中的荧光信号增强44.7至44.6倍。
双锁定探头pKa-CE在肝癌体内精确成像和术中导航中的应用
为了确保pKa-RH在肝脏中的蓄积，我们研究了尾静脉注射pKa-RH3(20μM，100μL)后不同时间点小鼠体内荧光信号的分布。该染料在肝脏中的信号逐渐增强，表明pKa-RH用于小鼠肝脏功能成像的潜力。此外，我们对主要器官(心、肝、脾、肺和肾)进行了苏木精-伊红(H&E)染色的组织学分析，证实这些染料适合于体内研究和进一步的生物学研究。其次，评价双锁定探针pKa-CE(20μM，100μL)用于肿瘤精确成像的可行性。最初，我们将pKa-CE注射到荷瘤的HepaG-2小鼠体内。正常组织在注射探针后表现出可忽略的荧光。在肿瘤组织中，信号持续增强，在5min内达到显著水平，60min内信号增强18.0倍。用5-FU诱导更高浓度的CE后，肿瘤组织中的荧光信号显著增加26.2倍。相比之下，用TPP抑制CE活性的小鼠的荧光信号显著减弱，仅增强了7.0倍。这表明，当CE浓度升高时，该探针可以快速响应肿瘤生物标记物CE和弱酸性pH，从而实现高荧光增强。随后，通过分离和成像小鼠的器官和肿瘤，我们在5-FU治疗组的肿瘤中观察到显著增强的荧光信号，进一步表明基于AIPT的探针在有效的肿瘤成像方面的高潜力。同时，当将pKa-RH3注射到肿瘤和正常组织中时，仅显示出较弱的分辨能力，进一步突显了双锁定探针pKa-CE用于肿瘤成像的更高的灵敏度和准确性。此外，我们还探索了pKa-CE在原位肝细胞癌成像中的潜力。我们通过尾静脉注射pKa-CE给荷原位肝癌的小鼠。注射后10min，荷瘤小鼠肝脏内迅速出现荧光信号，60min时T/N值达到5.0。同时，体外荧光成像显示，携带HC的小鼠肝脏的荧光信号比其他组高8.0倍。因此，该探头在原位肝细胞癌肿瘤的精确成像中显示出优势。在皮肤切开后，将pKa-CE均匀地喷洒在原位肝癌及其周围组织上，导致肿瘤组织内的荧光显著增加，T/N比达到11.0。这一令人印象深刻的表现表明了双锁定探头pKa-CE在图像引导手术中的适用性。随后，我们将探针喷洒到皮下肿瘤上。术后原发肿瘤区域未见明显荧光。此外，小鼠体重持续增加超过14天，手术伤口逐渐愈合，未见肿瘤复发，确认术中导航取得了令人满意的结果。肿瘤组织中CE和乳酸浓度较高，HE染色显示肿瘤区域清晰，证实肿瘤模型建立成功。
结论
我们报道了一种用于体内肿瘤精确成像的通用的“分析物诱导pKa可调”(AIPT)半蓝氨酸双锁定平台(pKa-RH)，其中pKa值可被光学可调位置的供电子强度方便而系统地调节。在AIPT策略的基础上，我们进一步设计了双锁定探针pKa-CE(pKa=5.4)和pKa-Cys(pKa=4.9)，分别对CE和Cys进行自发结构重构，原位生成共同的前体分子pKa-RH3。这一过程增强了识别单元的供电子能力，从而将探针的pKa提高到6.6，并激活其对肿瘤酸性pH条件的反应，从而实现高保真双锁定成像。两种双锁定探头都表现出卓越的成像性能，具有快速反应和高灵敏度的特点，在体内实现了高T/N比，能够清晰地区分肿瘤和邻近的正常组织，并指导手术切除。总体而言，基于AIPT策略的双锁定探针在复杂肿瘤模型的准确和快速成像方面显示出巨大的潜力，为双锁定荧光成像探针的未来发展提供了关键的见解，并有助于更合理地阐明生理和病理条件下的生物学机制。
参考文献
Analyte-Induced pKa‑Tunable Hemicyanine Dual-Locked Molecular Platform forIn Vivo Tumor Precision Imaging，Zhangkang Lv,Jingting Huang,Jing Wang,Jinyuan Xu,Hao Feng,Xing-Can Shen,and Hua Chen，Anal. Chem. 2025, 97, 25916−25927，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c06353
