内容提要
UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）是一种重要的代谢酶，负责清除内源性物质和药物。本研究建立了一种新的“分子剪接”策略，构建了UGT1A1高选择性近红外(NIR)荧光探针HHC，该探针在UGT1A1代谢后720 nm处显示出NIR信号。然后成功地将HHC用于活细胞和动物内源性UGT1A1的实时成像，并监测胆汁排泄功能。
实验结果与讨论
为了研究NIR荧光团半花菁(HC)的最佳荧光位点，制备了几种在C-6 (Comp 1)、C-5 (Comp 2)、C-7 (Comp 3)和C-8 (Comp 4)位置具有不同羟基的化合物。分析了这些化合物的光谱性质如图，结果表明只有Comp 1在720 nm处表现出明显的荧光，而Comp 2-4则没有荧光。在确定HC荧光活性位点后，研究UGTs介导的代谢识别位点。Comp 1-4的UGT异构体选择性在各种UGT异构体中进行。对于Comp1 (6-OH-HC)， UGT1A1、1A3、1A8和1A10均表现出较好的催化活性。对于Comp3 (7-OH-HC)， UGT1A1、1A3、1A4、1A7、1A8和1A10参与了葡萄糖醛酸化反应，其中UGT1A7表现出较高的催化活性。对于C-8羟基的Comp 4, UGT1A3和1A7均表现出较高的催化活性。对于含有HC 5-OH的Comp 2, UGT1A1对葡萄糖醛酸化表现出更高的选择性和反应速率，代谢效率是其他UGT亚型的7 - 22倍以上。同时，Comp 2对UGT1A1的糖醛酸化活性远高于Comp 1、3和4。因此，HC的5-OH基团被确定为UGT1A1的最佳代谢识别位点。
为了快速开发高选择性的酶激活荧光探针，采用了将给定酶的识别位点与目标荧光团的荧光位点进行剪接的设计策略，即取代基的“OFF”剪接，构建酶激活荧光探针。作为对UGT1A1的“分子剪接策略”的案例研究;首先确定HC对UGT1A1的最佳识别位点(5-OH)和HC的荧光活性位点(6-OH)，然后将Comp 1 (6-OH-HC，含荧光活性位点)和Comp 2 (5- oh -HC，含识别位点)结合得到5,6 -二酚-半花青碱(HHC, Comp 5)。由于邻二酚羟基的“OFF”剪接，HHC不产生荧光输出，同时是UGT1A1的有利识别位点(5-OH)。然后，在HHC的有利识别位点(5-OH)被UGT1A1葡萄糖醛酸化形成HHC-5- B -d -葡萄糖醛酸苷(HHC-G)后，邻二酚的“OFF”剪接被阻断，导致近红外荧光的出现。因此，HHC可以作为UGT1A1的潜在关-开近红外荧光探针。
根据上述设计策略，评估了HHC对UGT1A1的光谱响应。经UGT1A1在690 nm处有一个吸收峰，并在720 nm处有一个显著的荧光开关响应，这证实了“分子剪接策略”对HHC的适用性。值得注意根据LC-HRMS分析，UGT1A1的HHC代谢产物为单糖醛酸化产物，通过二维NMR鉴定葡萄糖醛酸化位点为C-5位置，这符合的“分子剪接策略”。对特定目标酶的选择性导致了荧光探针在复杂生物系统中的广泛应用。因此，评价荧光探针的选择性HHC，一组人类UGT同种异构体在相同条件下平行使用。在各种UGT异构体中，只有UGT1A1能触发荧光强度增强，而其他UGT异构体的荧光响应较弱。UGT1A1介导的HHC-G的形成率比其他ugt高16倍。此外，荧光强度的变化与UGT1A1酶浓度的增加(r2= 0.9935)和不同孵育时间呈良好的线性相关。
为了验证HHC对UGT1A1的选择性，进行了化学抑制，只有UGT1A1选择性抑制剂NBF可以阻断反应，剩余活性为15%。NBF在HLMs (10.43 mM)和UGT1A1 (7.89 mM)体系中抑制HHC糖醛酸化的IC50值相似，证实了复杂体系中HHC对UGT1A1的高选择性。最后，采用HHC法测定22个个体HLMs的UGT1A1活性，结果表明，由于UGT1A1显著的基因多态性，UGT1A1活性在不同HLMs中表现出16倍的差异。为了阐明UGT1A1与Comp 1、2和HHC之间的结合相互作用，利用Sybyl X-2.1中的Surflex对接模块进行了分子对接研究。结果表明，三种化合物都能很好地进入UGT1A1的催化腔，但三种化合物的结合模式有所不同。其中，Comp 1与UGT1A1中Ser38侧链形成一个氢键。此外，Comp 1的c -6氧原子与His39 (UGT1A1中的关键催化氨基酸)咪唑环上的氮原子之间的距离为5.72 Å，这导致Comp 1的催化活性较低。Comp 2和HHC的对应距离分别为2.70 Å和2.49 Å，与催化活性高度匹配。除组氨酸 39（His39）残基外，Comp. 2还与谷氨酰胺 185（Gln185）形成氢键相互作用。与Comp. 2相比，HHC 与脯氨酸 152（Pro152）和天冬氨酸 396（Asp396）残基额外形成两个氢键。Comp 2和 HHC 与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 1A1（UGT1A1）的结合亲和力强于Comp 1，这与实验结果一致，Comp 2和 HHC 对尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 1A1 的催化效率和选择性均高于Comp 1。
作为一种实用的荧光探针，随后探究了 HHC 在活细胞中的荧光成像能力。首先，通过 CCK8 实验证实，HHC 对活细胞无细胞毒性。HepG2 细胞与 HHC 孵育后，在红色通道（690-750 nm）检测到显著的荧光信号，这表明 HHC 具有良好的细胞通透性，且内源性 UGT1A1 可对其进行高效催化，而对照组未检测到荧光信号。还利用LoVo 细胞实现了内源性 UGT1A1 的可视化观察。通过流式细胞术对 HHC 进行了评估，HepG2 细胞和 LoVo 细胞与 HHC 孵育后，其荧光信号均比对照组出现显著偏移。为验证 HHC 在活体内对 UGT1A1 的高选择性，使用 siRNA 转染的 HepG2 细胞（UGT1A1 基因敲除）和对照组细胞进行了荧光成像实验。活细胞经 siRNA 预处理以敲低 UGT1A1 表达后，荧光信号显著减弱，且WB实验证实 UGT1A1 表达下调。经 UGT1A1 诱导剂处理后，UGT1A1 的表达水平上调，且荧光信号显著增强。在 UGT1A1 敲低和上调实验中，荧光信号的变化均与 UGT1A1 蛋白表达水平一致，这证实细胞内的荧光信号主要依赖于 UGT1A1 介导的 HHC 葡萄糖醛酸化反应。综上，这些结果表明 HHC 能够准确、特异地检测多种活细胞中的内源性 UGT1A1 活性。
利用 HHC 对肿瘤组织中的 UGT1A1 进行了成像检测，对照组肿瘤组织切片未检测到背景荧光，而在 HepG2和 LoVo癌细胞组织切片中均观察到显著的荧光信号。这些结果共同表明，HHC 可作为一种极具潜力的工具，用于监测细胞、组织等复杂生物系统中的 UGT1A1 活性，为临床多种癌症的手术诊断和治疗提供有用指导。经 UGT1A1 诱导剂处理后，UGT1A1 的表达水平上调，且荧光信号显著增强。在 UGT1A1 敲低和上调实验中，荧光信号的变化均与 UGT1A1 蛋白表达水平一致，这证实细胞内的荧光信号主要依赖于 UGT1A1 介导的 HHC 葡萄糖醛酸化反应。这些结果表明 HHC 能够准确、特异地检测多种活细胞中的内源性 UGT1A1 活性。
UGT1A1在肝脏中高表达，负责内源性和外源性化合物的结合与解毒，尤其是内源性胆红素。此外，UGT1A1 催化生成的葡萄糖醛酸苷代谢产物可通过乳腺癌耐药蛋白（BCRP）等胆汁外排转运体快速从肝脏排出。基于 UGT1A1 的生物学功能，利用 HHC 独特的 “点亮型” 近红外（NIR）信号，评估了其在活体动物中实时可视化内源性 UGT1A1 的能力。给予 HHC 后，检测到显著的荧光信号，且该信号在 30 分钟内持续增强，值得注意的是，荧光信号定位于 UGT1A1 表达最丰富的器官 —— 肝脏区域。对小鼠不同器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肠道）进行的 UGT1A1 体外成像结果显示，仅肝脏呈现出显著的荧光信号，这与活体动物的在体成像结果一致。有趣的是，给予 HHC 2 小时后，荧光信号集中于胆囊区域，这表明肝脏中形成的葡萄糖醛酸苷代谢产物（HHC-G）可随胆汁一同排出。含有 HHC-G 的胆汁直接流入胆囊，导致近红外荧光在胆囊内积累。利用原代肝细胞成对细胞，通过 HHC 对胆汁排泄过程进行了成像观察。向肝细胞成对细胞中加入 HHC 后，观察到 10 分钟至 40 分钟内的荧光信号变化：前 10 分钟内，HHC 在肝细胞成对细胞中经 UGT1A1 代谢生成 HHC-G，使荧光分布于细胞质中；随后 HHC-G 从细胞质外排至细胞成对腔隙，荧光信号部分转移至细胞成对腔隙中。长时间孵育（40 分钟）后，HHC-G 完全外排至毛细胆管，此时可在细胞成对腔隙中观察到强荧光信号。肝细胞成对细胞的实时荧光成像清晰呈现了 HHC-G 的排泄过程。为验证 HHC-G 是否为乳腺癌耐药蛋白（BCRP，胆汁排泄过程中的关键外排转运体）的底物，在 BCRP 过表达的 MDCK 细胞系和空载体对照（MOCK，无 BCRP 表达）MDCK 细胞系中进行了荧光成像实验。由于过表达的 BCRP 转运体介导的排泄作用，BCRP 表达细胞的荧光强度低于空载体对照细胞。所有这些结果明确表明，HHC 可用于活体动物体内 UGT1A1 的在体成像，且葡萄糖醛酸苷代谢产物 HHC-G 是 BCRP 转运体的底物。综上，HHC 可作为一种分子工具，用于检测活体动物肝内 UGT1A1 的活性，并通过胆汁监测肝脏的外排功能，为肝脏相关疾病的诊断提供支持。受 UGT1A1 激活型荧光探针（HHC）检测胆汁外排功能这一特性的启发，建立了胆固醇胆结石小鼠模型，以评估 HHC 在胆汁盐饮食诱导的病理状态下，对胆结石模型中外排功能监测的实用性和可靠性。小鼠经胆汁盐饮食喂养 5 周后，通过肉眼和偏振光显微镜观察到其胆囊内出现结石结晶；而正常饮食组小鼠的胆囊呈半透明状，未出现明显的胆结石形成。胆固醇胆结石组的结石重量显著高于正常组，且胆结石模型中小鼠的总胆汁酸（TBA）浓度大幅升高。所有结果表明，胆汁胆结石模型构建成功。
结论
本研究基于半花菁荧光团，通过一种新型 “分子拼接策略”，成功开发出针对 UGT1A1的近红外荧光探针 HHC。该探针对 UGT1A1 活性的实时检测具有高选择性和高灵敏度。HHC 可用于监测活细胞及动物模型的胆汁排泄功能，还能作为高通量筛选工具，快速发现潜在的 UGT1A1 抑制剂，从而规避临床用药过程中的肝毒性风险。该 “分子拼接策略” 可作为一种有效的方法，用于开发其他酶激活型及亚型特异性荧光探针。
参考文献
A Molecular-Splicing Strategy for Constructing a Near-Infrared Fluorescent Probe for UDP-Glucuronosyltransferase 1A1，Xiangge Tian , Tao Liu , Yinhua Ma , Jian Gao, Lei Feng, Jingnan Cui, Tony D. James and Xiaochi Ma，Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 24566– 24572，https://doi.org/10.1002/anie.202109479.
