内容提要
本研究开发了一种硫化氢激活的双模态光疗诊疗纳米平台（N-BOD-P-T），该平台利用硫化氢激活的近红外二区成像引导的光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT），实现结直肠肿瘤的精准光消融。N-BOD-P-T能够选择性地在硫化氢高表达的结直肠肿瘤处积聚，并发生从近红外一区到近红外二区的荧光转换。
实验结果与讨论
PSs的合成与硫化氢激活的封装光敏剂的光物理性质
对商业苯甲酰氯进行胺化反应，得到化合物B1。B1与卤代吡咯发生Vilsmeier酰化反应，主要生成化合物B3，同时产生少量化合物B2。在氯化铜存在下，化合物B2可转化为化合物B3。通过Knorr吡咯合成反应合成化合物B4，接着经脱酯和脱羧反应生成化合物B5。在酮还原条件下，得到不稳定的中间体B6，其与化合物B3反应生成化合物B7。化合物B7经即时硼插入反应得到化合物BOD-Cl，然后使用三氯氧磷和N,N-二甲基甲酰胺将其转化为化合物BOD-CHO。化合物OH-BOD经碘化反应得到化合物I-BOD。化合物I-BOD通过与1,5-二碘戊烷的亲核取代反应转化为中间体I-BOD-1。在三甲基吲哚存在下制备了化合物I-BOD-2。关键化合物BOD-P-Cl通过化合物BOD-CHO与I-BOD-2在乙醇中回流条件下的Knoevenagel缩合反应获得。采用类似方法合成了简化化合物BOD-S。A1与A2在碱性条件下反应生成化合物Aza-1。随后与硝基甲烷发生1,4-加成反应，得到化合物Aza-2。最后，通过缩合及后续的硼插入反应合成了化合物Aza-BOD-T。
研究了光敏剂BOD-P-Cl对H₂S的光学变化。在PBS/ACN缓冲液（1:1，v/v，pH=7.4）中，BOD-P-Cl在534 nm处有一个初始吸收峰，在592 nm处有一个强发射峰（ϕ=12.17%）。暴露于100μM NaHS后，在768 nm左右出现了一个新的吸收带，同时534 nm处的原始峰因I-BOD的吸收而下降但未完全消失，这导致了176 nm的显著红移。同时，BOD-P-Cl在近红外一区（NIR-I）的固有发射带逐渐减弱。在808 nm波长激发下，在936 nm处观察到明显的近红外二区（NIR-II）荧光，并呈现出随时间增强的趋势。当NaHS浓度从0增至25μM时，936 nm处的荧光强度与之呈现出良好的线性相关性。经计算，BOD-P-Cl的检测限（LOD）为0.065μM，表明其对H₂S具有灵敏的检测能力。我们以1,3-二苯基苯并呋喃（DPBF）作为单线态氧（¹O₂）指示剂，以亚甲基蓝作为参考标准，评估了BOD-P-Cl在530 nm光照下产生单线态氧（¹O₂）的光动力性能。在含有BOD-P-Cl的二甲基亚砜溶液中，DPBF的吸光度在几秒内迅速下降，410 nm处吸光度的时间依赖性衰减呈现出强烈的线性相关性，这证实了其优异的¹O₂产生能力。BOD-P-Cl的单线态氧量子产率（QY）为39%，这归因于I-BOD的重原子效应增强了系间窜越。因此，BOD-P-Cl是一种潜在的H₂S激活型近红外二区探针和光动力光敏剂，可用于进一步的成像引导光动力治疗。
基于其优异的光动力特性，我们随后通过监测785 nm光照射下PBS缓冲液的温度变化，研究了光热光敏剂Aza-BOD-T的光热性能。温度升高受到Aza-BOD-T浓度和激光功率密度的正向影响。反复的加热和冷却实验表明，最高温度没有显著变化，这证实了光敏剂Aza-BOD-T具有优异的光热稳定性。Aza-BOD-T的温度范围为26至45°C，被认为对皮肤组织是安全的。此外，在3.0 W/cm²的功率密度下，785 nm激光照射下的光热转换效率（PCE）为36.2%，这是评估光敏剂光热性能的关键指标。优异的光热性能加上出色的光热稳定性表明，Aza-BOD-T作为一种先进的光热光敏剂具有巨大的应用前景。
为了提高光敏剂（PSs）的生物相容性，并开发一种双模态光疗光敏剂，同时保留其固有的光物理特性，我们使用DSPE-PEG2000将光敏剂包裹到纳米颗粒中（N-BOD-P-T）。动态光散射（DLS）实验显示，N-BOD-P-T的平均水合直径为30±5纳米。加入100μM硫氢化钠（NaHS）后，N-BOD-P-T表现出依赖于硫化氢（H₂S）的光学变化。值得注意的是，硫氢化钠处理导致近红外一区（NIR-I）荧光强度显著降低，同时在808纳米激发下产生强烈的近红外二区（NIR-II）荧光。此外，除引入硫氢化钠外，近红外二区荧光无明显变化，这证实了该响应具有硫化氢特异性。在6.0-8.5的生理pH范围内，N-BOD-P-T对硫化氢的近红外二区荧光响应保持稳定。此外，N-BOD-P-T保持了与Aza-BOD-T相当的优异光热性能。与单独的光敏剂相比，N-BOD-P-T表现出更快的硫化氢响应速度、更好的水溶性和生物相容性，以及双模态光疗能力。因此，N-BOD-P-T可作为一种优良的硫化氢激活型近红外二区探针和双模态光疗光敏剂，用于硫化氢高表达结直肠癌的成像引导光动力疗法（PDT）/光热疗法（PTT）。
N-BOD-P-T在结直肠细胞中的体外评估
基于N-BOD-P-T优异的光物理特性，我们在体外研究了其诊疗潜力。通过CCK-8实验评估了N-BOD-P-T在富含硫化氢的HCT116细胞中的细胞毒性。用不同浓度的N-BOD-P-Cl或N-Aza-BOD-T处理HCT116细胞。当纳米颗粒浓度为25μM时，在无激光照射的情况下，细胞存活率几乎保持在90%以上，表明其具有优异的生物安全性。此外，当HCT116细胞分别接受530nm、785nm激光照射或530/785nm双模态激光照射时，未观察到明显的细胞死亡，这证实了这些激光具有较高的光生物学安全性。为了在体外研究N-BOD-P-T的硫化氢靶向能力，我们通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）验证了N-BOD-P-T对HCT116细胞内源性硫化氢的特异性响应。N-BOD-P-T的荧光强度在90分钟内逐渐增强，随后达到峰值。这一趋势表明，在存在内源性硫化氢的情况下，细胞对N-BOD-P-T的摄取量超过了其消耗量。此后，荧光信号逐渐减弱，表明N-BOD-P-T的还原作用占主导地位。我们随后用硫化氢清除剂AOAA预处理HCT116细胞。正如预期的那样，由于细胞内硫化氢被耗尽，近红外一区荧光强度并未随时间发生显著减弱。这些结果表明，在硫化氢高表达的HCT116细胞中，N-BOD-P-T可作为一种优异的硫化氢激活探针，具有高选择性和良好的生物安全性。N-BOD-P-T出色的硫化氢靶向能力不仅为体内影像引导治疗提供了保障，还有助于提高治疗精度并减少副作用。
为了研究N-BOD-P-T的光疗效果，使用钙黄绿素-AM和碘化丙啶对活细胞和死细胞进行染色。用PBS或单独使用N-BOD-P-T处理的HCT116细胞作为对照组，仅显示出明亮的绿色钙黄绿素-AM荧光，表明细胞存活。这些结果进一步证实了N-BOD-P-T的细胞毒性可忽略不计。与N-BOD-P-T共同孵育并在530nm或785nm波长下照射10分钟的细胞，显示出不同程度的碘化丙啶红色荧光，表明细胞死亡，同时伴有绿色荧光。这些结果表明，光敏剂N-BOD-P-T在特定激光照射下可产生显著的光动力或光热效应。值得注意的是，与光敏剂N-BOD-P-T共同孵育并接受530/785nm双模态照射的细胞几乎完全呈现红色荧光，仅残留微量绿色荧光，这反映出通过双模态光动力和光热效应，治疗效果显著增强。通过CCK-8实验进一步研究了N-BOD-P-T良好的光疗效果。当用光敏剂N-BOD-P-T联合530或785 nm激光照射10分钟时，细胞活力呈浓度依赖性下降（0–20 μM）。然而，当采用双模式530/785 nm照射时，无论照射顺序如何，光敏剂浓度与细胞活力之间均未观察到显著相关性。因此，我们进一步测定了N-BOD-P-T在530 nm、785 nm或双模式530/785 nm照射下的IC50。当用双模式波长照射时，N-BOD-P-T表现出显著的协同功效，IC50值为340.87 nM。与单独的光动力疗法（IC50 = 90.84 μM）或光热疗法（IC50 = 29.94 μM）相比，这代表了显著的增强。总之，N-BOD-P-T作为一种硫化氢激活的双模式光疗诊疗剂，在结直肠细胞中具有巨大的潜力和显著的协同功效。
N-BOD-P-T在HCT116荷瘤小鼠模型中的体内诊疗效果
为了进一步研究N-BOD-P-T在体内的诊疗效果，我们建立了HCT116异种移植BALB/c裸鼠模型，以研究N-BOD-P-T在体内的近红外二区（NIR-II）成像潜力。在向小鼠瘤内注射N-BOD-P-T后，由于N-BOD-P-SH的化学性质，肿瘤部位N-BOD-P-T的明亮近红外二区荧光呈现出时间依赖性增强，而当小鼠预先用硫化氢（H2S）清除剂AOAA处理时，未观察到明显的近红外二区荧光增强，这表明其具有优异的硫化氢靶向性能和出色的近红外二区成像能力。相反，由于在硫化氢存在下BOD-P-Cl被大量消耗，肿瘤部位的近红外一区（NIR-I）荧光信号逐渐减弱。当肿瘤预先用AOAA处理时，近红外一区荧光没有显著衰减。这些结果证实，N-BOD-P-T可作为一种很有前景的硫化氢激活型近红外二区探针和光敏剂，用于进一步的成像引导双模态光疗，以精确治疗结直肠癌。我们在瘤内注射N-BOD-P-T后，对HCT116荷瘤小鼠进行了双模态光疗。将小鼠随机分为6个实验组：A组（对照组）；B组（仅N-BOD-P-T）；C组（530 nm + 785 nm激光照射）；D组（N-BOD-P-T + 530 nm激光照射）；E组（N-BOD-P-T + 785 nm激光照射）；以及F组（N-BOD-P-T + 530 nm + 785 nm激光照射）。根据14天内HCT116荷瘤小鼠的相对肿瘤大小与对照组相比，单独的N-BOD-P-T处理或单独的激光照射均未显示出明显的肿瘤抑制作用。这些结果表明，在实验条件下，光敏剂N-BOD-P-T或激光具有良好的生物安全性。N-BOD-P-T联合530 nm激光照射处理能在一定程度上抑制肿瘤生长，这归因于肿瘤部位局部产生的单线态氧（1O2）。瘤内注射N-BOD-P-T联合785 nm激光照射表现出显著的肿瘤抑制效果，这表明N-BOD-P-T能有效实现肿瘤的热消融。然而，双模态光疗组在HCT116荷瘤小鼠中显示出协同效应，实现了对HCT116肿瘤的完全且精确的光消融。这些结果可能归因于双模态光疗克服了光热疗法（PTT）引起的肿瘤耐热性或光动力疗法（PDT）中的氧消耗问题。
结论
我们开发了一种诊疗纳米平台（N-BOD-P-T），用于在硫化氢激活的近红外二区成像引导下，通过双模态光疗精准光消融结直肠肿瘤。在我们的设计中，将一种硫化氢激活的近红外二区成像光动力光敏剂BOD-P-Cl和一种光热光敏剂Aza-BOD-T通过DSPE-PEG2000包封到纳米颗粒N-BOD-P-T中。BOD-P-Cl能够与结直肠肿瘤中高表达的合酶所产生的硫化氢选择性反应，从而生成BOD-P-SH，同时伴随从近红外一区到近红外二区发射的显著荧光转换，这表明它已靶向结直肠肿瘤组织，并为进一步实施光疗提供指导。随后，光敏剂BOD-P-Cl在530纳米激光照射下可有效产生单线态氧，以杀死结直肠肿瘤。同时，N-BOD-P-T中的Aza-BOD-T作为一种强效光热光敏剂，能够在吸收785纳米光后产生热能，从而损伤结直肠肿瘤。
参考文献
H2S-Activated Theranostic Platform for Precise Photoablation of Colorectal Tumors with NIR-II Dual-Modal Phototherapy，Kehuan Wu, Lixin Sun, Hongyu Wu, Xinru Zheng, Yongxing Xue, Ziwen Zhang, Shaozong Ma, Chunchang Zhao, Yingchao Liu,* and Xianfeng Gu*,J Med Chem. 2025, 68,24684-24700.DOI:10.1021/acs.jmedchem.5c02724.
