内容摘要
本研究报道一种用于原位肝细胞癌超灵敏诊断的腈-氨基硫醇（NAT）生物正交荧光探针 (CyNA~P~-SS-FK) 。该探针由腈基取代的半花青骨架和通过生物标志物响应基团双重锁定的半胱氨酸尾部组成。在肿瘤特异性组织蛋白酶 B 和生物硫醇的双重切割下，1,2-氨基硫醇残基暴露并自发与腈基反应进行原位分子内大环化，从而实现近红外荧光开启以及自组装。在雄性活体小鼠中，这种“切割-点击-组装”方案能够实时、超灵敏地检测到直径约2 毫米的小癌灶，提高了信噪比并延长了检测窗口。
实验结果与讨论
我们提出将半花青骨架中的给电子羟基替换为强吸电子的腈基，可以阻断分子内电荷转移并“关闭”近红外荧光信号。当腈基发生NAT点击反应生成噻唑啉时，由于电子密度显著变化，荧光信号得以恢复。为此，我们设计并合成了一系列氰基取代的半花青染料（CyN-1至CyN-5）。通过评估它们与游离半胱氨酸反应的二级速率常数和荧光增强情况，发现位于C-6位置的CyN-1具有最快的反应动力学和最高的荧光增强效果，因此被选为最佳的生物正交荧光发光体。
分子内 NAT 生物正交荧光发光体的筛选
为了构建由分子内NAT反应介导的荧光发光体，我们合成了通过不同长度和刚性的烷基链或PEG链连接N端半胱氨酸残基和半花青骨架的化合物CyNA~4~、CyNA~7~ 和 CyNA~P~。通过测定它们的一级反应速率常数和荧光增强倍数，发现带有柔性PEG连接子的CyNA~P~具有最高的分子内大环化动力学和最佳的荧光恢复效果。为了验证分子内环化的特异性，我们研究了CyNA~P~在高浓度游离半胱氨酸存在下的反应情况。高效液相色谱分析表明，即使在大量游离半胱氨酸存在下，CyNA~P~也优先进行分子内环化，而非分子间缩合。透射电子显微镜和动态光散射结果显示，环化产物CyNA~P~-C能自发组装形成平均直径约100纳米的球形纳米颗粒。细胞实验进一步证实，仅在含有谷胱甘肽响应性二硫键的探针（CyNA~P~-SS）处理的肝癌细胞中观察到显著的荧光信号，而在使用对谷胱甘肽不敏感的对照探针（CyNA~P~-S）或用谷胱甘肽合成抑制剂预处理的细胞中则信号微弱，证明了分子内环化在细胞环境中的高特异性。
双锁荧光探针的设计与表征
我们开发了一种用于肝细胞癌成像的双锁激活探针CyNA~P~-SS-FK。该探针由生物正交荧光发色团CyNA~P~、谷胱甘肽响应性二硫键和组织蛋白酶B可切割肽（Ac-FK）组成。探针本身无荧光，仅在同时存在谷胱甘肽和组织蛋白酶B时，经过两步切割释放出1,2-氨基硫醇残基，触发分子内NAT点击反应，从而恢复近红外荧光并自组装成纳米聚集体。该探针对谷胱甘肽和组织蛋白酶B表现出高度特异性和响应性，与其他生物分子无明显交叉反应，且在肝癌细胞中能有效激活荧光信号。
实时体内近红外荧光成像检测肝细胞癌
在原位肝癌小鼠模型中评估了CyNA~P~-SS-FK的成像能力。实验表明，在肿瘤植入后仅5天（肿瘤直径约2毫米）时，该探针即可实现肝脏肿瘤区域的清晰成像，信号强度随肿瘤生长而增强。与“始终开启”的对照探针相比，CyNA~P~-SS-FK具有更高的信噪比和更长的肿瘤滞留时间（超过36小时）。此外，该探针检测到肿瘤信号的时间点比临床血清谷丙转氨酶/谷草转氨酶检测和组织学检查提前了至少5-10天，显示出超高的早期诊断灵敏度。
结论
本研究提出了一种利用NAT点击反应的生物正交近红外荧光探针，用于肝细胞癌的体内成像。与广泛研究的具有“始终开启”信号的CBT-Cys探针相比，具有“裂解-点击-组装”传感机制的NAT荧光探针提供了增强的成像对比度和更长的检测窗口。通过简单地改变生物标志物响应部分，这种分子设计可用于创建一个通用工具包，以实现对肝细胞癌以外的各种疾病的超灵敏早期诊断。
参考文献
Nitrile-Aminothiol Bioorthogonal Near-Infrared Fluorogenic Probes for Ultrasensitive In Vivo Imaging, WeipingXu, ShujuanYi, JieLiu, YuyanJiang ,JiaguoHuang, Nat. Commun., DOI:10.1038/s41467-024-55452-y.
