内容提要
本研究介绍一种酶反应自固定的小分子MRI探针P-QM-Gd用于高灵敏度的肿瘤成像。当被膜结合的碱性磷酸酶(ALP)激活后，P-QM-Gd被酶转化为反应性的苯醌甲基中间体。这些中间体很容易与近端的蛋白质残基发生亲核加成反应，使顺磁性Gd络合物能够直接共价连接到肿瘤细胞膜上。这种酶的自固定化显著提高了纵向弛豫度(R1)，从7.35 mM−1 S−1(0.5T，21.3 MHz，32°C)增加到13.15 mM−1 S−1，并有效地将探针捕获在肿瘤部位。P-QM-Gd显示肿瘤快速摄取和有效的共价标记，实现了明显的MR对比增强(60%)。在皮下HeLa和原位K7M2肿瘤模型中，成像窗口延长到24小时。使用P-QM-Gd的延迟磁共振成像能够精确地显示小鼠~1.3 mm原位K7M2肿瘤。
实验结果和讨论
我们设计了P-QM-Gd，这是一种ALP触发的自固定化MRI探针，可以选择性地用Gd-DOTA络合物标记ALP阳性的肿瘤细胞，用于延迟肿瘤成像。P-QM-Gd由亲水性磷酸基团(PO3H2)、不稳定的邻二氟甲基对羟基苯乙基氨基甲酸酯固定化支架和用于Gd3+离子配位的DOTA螯合剂组成。这种不稳定的支架实现了1，4-和1，6-消除过程，生成了反应性的甲基喹啉(o-QM和p-QM)亲电体。这些亲电中间体容易与近端的蛋白质残基发生亲核加成反应，导致自我固定化和形成稳定的共价加合物。得到的GdDOTA螯合物-蛋白质结合物显著大于母体P-QM-Gd，通过增加Gd-QM-Gd络合物的分子翻滚时间(τR)来限制分子旋转并增加R1的弛豫时间。此外，这种酶促自固定化机制利用了碱性磷酸酶的催化活性，将多个P-QM-Gd分子转化为Gd-DOTA螯合物-蛋白质结合物，从而有效地丰富了肿瘤细胞膜上的Gd-DOTA络合物。为了研究自固定过程的作用，我们合成了一个对照探针P-Ctrl-Gd，它含有相同的亲水性磷酸基团和DOTA-Gd螯合物，但缺乏不稳定的自固定支架。P-Ctrl-Gd在去磷酸化后不能进行碱性磷酸酶触发的自我固定化，支持自我固定化过程在通过延迟MRI增强肿瘤检测中的关键作用。P-QM-Gd和P-Ctrl-Gd的合成如方案所述。用核磁共振、高分辨质谱仪或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对其结构进行了表征。此外，我们还合成了一种用于荧光成像的近红外荧光探针P-QM-Cy5.5，它具有相同的酶响应和自固定化特性。
我们首先在体外验证了PQM-Gd对蛋白质的酶标记能力。将P-QM-Gd与碱性磷酸酶(100U/L)在Tris缓冲液中孵育，分别加入或不加入牛血清白蛋白，研究P-QM-Gd在碱性磷酸酶介导下对蛋白质的去磷酸化和自固化作用。在不含牛血清白蛋白的Tris缓冲液中孵育的高效液相色谱(HPLC)分析显示，P-QM-Gd迅速脱磷，并在30分钟内完成。在BSA存在的情况下，从孵育液中沉淀蛋白质(包括BSA和标记的BSA)，并对上清液进行高效液相分析。在高效液相色谱中观察到P-QM-Gd及其脱磷产物的峰强度逐渐降低，这可能是由于生成的QM中间体对BSA残基的亲核攻击，导致共价加合物的形成和它们在沉淀物中的捕获。为了优化标记效果和松弛过程，对标记溶液中的BSA浓度进行了筛选。结果发现，在低浓度的BSA溶液中，P-QM-Gd的MRI背景信号相对较低，而随着BSA浓度的升高，这些信号逐渐增强。在所测试的牛血清白蛋白浓度中，当牛血清白蛋白浓度为2%时，标记前后的T1驰豫时间差异最大。为了最大限度地减少背景信号，实现大信号增强，选择2%牛血清白蛋白作为最佳浓度。然后，我们评估了P-QM-Gd在BSA上的标记效率。将不同浓度的P-QM-Gd与碱性磷酸酶(100U/L)在含2%牛血清白蛋白的Tris缓冲液中孵育30min。采用体积排阻层析法将未标记的小分子Gd-DOTA从Gd-DOTA标记的蛋白质中分离出来，并用电感耦合等离子体光发射光谱(ICP-OES)对蛋白质组分中的Gd3+进行定量。近90%的P-QM-Gd在约200微米处与蛋白质共价结合，表明P-QM-Gd在碱性磷酸酶作用下标记蛋白质的效率很高。在100U/L碱性磷酸酶激活后，P-QM-Gd(100µM)在2%牛血清白蛋白溶液中的纵向弛豫时间持续减少30min。随后的R1弛豫度测量显示，碱性磷酸酶显著增强了P-QM-Gd在2%牛血清白蛋白溶液中的R1弛豫度，从7.35±0.3 mM−1 S−1增加到13.15±0.4 mM−1 S−1(0.5T，21.3 MHz，32°C)。我们还测量了P-QMGd在3T(临床常用的磁场强度)下的R1弛豫度，从5.78±0.24mM−1 S−1标记后增加到7.91±0.19mM−1 S−1。相反，当与不含BSA的碱性磷酸酶孵育时，P-QM-Gd没有表现出增加的R1弛豫度，因为大多数去磷酸化的产物仍然是小分子。此外，当对照探针P-Ctrl-Gd在2%BSA存在的情况下与ALP孵育时，并不增强R1的驰豫作用。这些结果支持了PQM-Gd背后的设计原理：酶促自固定化标记过程有效地将Gd-螯合物连接到大分子蛋白质(例如，BSA)上，从而产生更高的Per-Gd R1驰豫率。在含2%牛血清白蛋白的溶液中与碱性磷酸酶孵育后，增加的R1弛豫度可在1T时提供更明亮的T1加权MR图像。此外，证实了P-QM-Gd选择性标记BSA，其中仅ALP处理导致T1弛豫时间缩短和T1加权MR信号增强。高效液相分析进一步证实了P-QM-Gd对碱性磷酸酶的高选择性。有人指出，共价标记牛血清白蛋白后，PQM-Gd的R1值低于以前报道的白蛋白结合探针的R1值，后者通过非共价结合到牛血清白蛋白上的脂肪酸结合部位，使R1值超过50 mm−1 S−1。这种较低的R1值可能是因为在我们的系统中，Gd-络合物共价标记在牛血清白蛋白表面，而不是结合到白蛋白的疏水口袋上，白蛋白的疏水口袋由于存在柔性接头的存在而经历了更快的内部运动。
P-QM-Gd与对照探针(P-Ctrl-Gd和DTPA-Gd)在含有2%BSA的溶液中的对比成像显示出不同的行为。通过MWCO超滤后，由于超滤过程中探针的清除，所有不含ALP的组在滤液中显示出类似的低MRI信号，然而，经ALP处理的P-QM-Gd显示出显著的T1对比度增强，而添加ALP后，DTPA-Gd(无酶反应)和P-Ctrl-Gd(酶反应但非共价)的信号强度都没有明显变化。这些结果表明，与传统的小分子类似物相比，酶自固定化探针在延长靶点保留时间和放大成像信号方面具有优势。我们进一步考察了在相同探针浓度下，P-QMGd在2%BSA溶液中孵育时间的影响。在30min的孵育过程中，Gd3+在蛋白质上的标记效率逐渐增加，并伴随着MRI信号的增强。超滤液的MR信号增强明显高于未超滤液，30min时最大信号增强率(SE)为210%，是相同条件下未超滤液的3.6倍。当P-QM-Gd与不同活性的碱性磷酸酶孵育30min时，超滤前后的增强作用相差3-4倍。这些发现表明，基于QM的自固定化策略限制了Gd3+的扩散，提高了信号背景比(SBR)和检测灵敏度。
在展示了碱性磷酸酶催化的P-QM-Gd在牛血清白蛋白上的自固定化标记能力后，我们将该探针应用于检测培养的肿瘤细胞中的碱性磷酸酶活性。P-QM-Gd的细胞毒性用标准的四甲基偶氮唑盐比色法进行了评估，结果显示，即使在高达800微米的浓度下，P-QM-Gd对人宫颈癌细胞(HeLa)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞活力影响也很小。在优化培养条件后，P-QMGd(200微米，30分钟)能够选择性地标记具有丰富顺磁性Gd-螯合物的HeLa细胞，提供明亮的T1加权磁共振信号。P-QM-Gd处理的HeLa细胞颗粒的MR对比度显著高于Na3VO4处理的HeLa细胞、ALP缺乏的HUVEC或U87 MG细胞以及与DTPA-Gd孵育的HeLa细胞。MR对比定量显示，与P-QM-Gd孵育的HeLa细胞表现出约220%的最大信号增强。相比之下，Na3VO4处理或DTPA-Gd孵育的HeLa细胞表现出低得多的增强(≈40%-50%)，这与缺乏碱性磷酸酶表达的人脐静脉内皮细胞或U87 MG细胞相当。随后的电感耦合等离子体发射光谱分析证实，与P-QM-Gd孵育的HeLa细胞的Gd3+含量为~1.32fmoL/cell，比缺乏碱性磷酸酶的人脐静脉内皮细胞、U87 MG细胞或Na3VO4处理的HeLa细胞(~0.1fmoL/cell)高10倍以上。进一步对分离的细胞膜和胞浆组分进行的电感耦合等离子体发射光谱分析表明，Gd3+主要分布在P-QM-Gd处理的HeLa细胞的膜组分中，而对照探针(P-Ctrl-Gd)处理的HeLa细胞膜和胞浆中的Gd3+水平显著降低。为了进一步检测细胞标记后探针的分布，使用P-QMCy5.5进行荧光成像。10µM PQM-Cy5.5孵育30分钟后，在细胞膜上观察到明显的荧光信号。相反，在Na3VO4预处理的HeLa细胞或ALP阴性的HUVEC细胞中观察到的荧光可以忽略不计。进一步的凝胶内荧光分析表明，主要标记的是膜蛋白，而不是细胞内蛋白。这些发现表明，P-QM-Gd可以被膜结合的ALP有效地去磷酸化，从而允许产生的QMS标记ALP高表达的肿瘤细胞表面。
我们应用P-QM-Gd通过磁共振成像来检测皮下荷HeLa肿瘤小鼠的内源性ALP。静脉注射P-QM-Gd的血浆半衰期最初的检查显示，血液半衰期(T1/2)为30.8min，大约是DTPA-Gd的2倍。然后，在基线以及注射P-QM-Gd、P-Ctrl-Gd或DTPA-Gd(0.05mmol kg−1Gd3+)后1、2、4、8、12和24小时进行T1加权磁共振成像。给予P-QM-Gd后，HeLa肿瘤的T1加权MR对比度逐渐增强；肿瘤的最大信号增强百分比(%SE)在2小时时达到约69%，分别比P-Ctrl-Gd(含有磷酸基团的对照探针，但不能产生QM中间体)和临床使用的DTPAGd治疗的肿瘤分别高5.1倍和6倍。HeLa肿瘤的多层MR图像的3D重建显示，MRI信号在整个肿瘤组织中广泛增强，显示了探头能够深入组织进行有效的MR成像。值得注意的是，即使在注射后24小时，肿瘤部位仍有强烈的磁共振信号，%SE仍高达~52%。而向肿瘤内注射10 mM，50µm L，两次注射抑制碱性磷酸酶活性时，肿瘤组织中%SE仅为~13%，24小时后降至5%以下，这些结果支持肿瘤组织增强的MR对比度依赖于碱性磷酸酶的活性。此外，在第一次注射后24小时第二次注射P-QM-Gd后，肿瘤区域的%SE增加了1.3倍。这种长时间的保留归因于通过所提出的碱性磷酸酶催化的自固定标记过程，探针与肿瘤细胞膜的共价结合，与未标记的小分子探针相比，显著增强了肿瘤与正常组织的对比度。在相同的HeLa肿瘤模型中使用P-QM-Cy5.5的互补近红外荧光成像证实了这些发现。此外，还研究了Gd3+在肿瘤和其他主要器官(如心、肝、脾、肺、肾、肠和胃)中的分布。静脉注射后4h。注射P-QMGd后，肿瘤组织中Gd3+的存留率最高，为14.3±1.9%ID/g。24小时后，未活化的P-QM-Gd通过肾脏系统被清除，非靶区正常组织特别是肾脏中的Gd含量降至5.69±0.79%ID/g，而Gd3+在肿瘤中的滞留量仍保持在13.48±2.0%ID/g，这一特点使得成像前有一段等待时间将探针从非靶区组织中清除出去，从而导致较高的SBR和延长的肿瘤成像窗口。这些发现证实了P-QM-Gd可以有效地渗透到肿瘤组织中，被激活，特异性地标记靶点，延长保留时间，增强MR对比度，使其成为一种有希望的体内成像探针。
结论
我们已经成功开发了一种酶指示的自固定化MRI探针(P-QM-Gd)，它能够实现高灵敏度、长时间的肿瘤成像。通过利用肿瘤细胞膜上碱性磷酸酶的活性，P-QM-Gd经酶活化，产生活性QM中间体。这些亲电中间体促进了Gd-螯合剂与膜蛋白的共价偶联，有效地固定了它们。这种固定化有助于限制分子旋转，导致纵向R1弛豫度增加约2倍，并增强MR信号。体内研究表明，在皮下HeLa和原位K7M2肿瘤模型中，肿瘤快速摄取、延长滞留和显著的MR对比度，实现了60%以上的最大信号增强和长达24小时的成像窗口。此外，P-QM-Gd延迟磁共振成像可以早期发现小的原位K7M2肿瘤(~1.3 mm)，并具有高空间分辨率。P-QM-Gd通过酶自固定化标记过程，有效地解决了传统小分子Gd基磁共振探针快速洗脱和低灵敏度的挑战，为延迟磁共振肿瘤成像提供了一种有前途的解决方案。与以前报道的其他基于可逆化学反应的固定化MRI探针相比，P-QM-Gd使用的是自固定标记，这种标记是不可逆的，并且可以在肿瘤部位保留较长时间(从几天到几周)。这一功能对于延迟和长期的肿瘤成像特别有益。
参考文献
A Smart Self-Immobilization Magnetic Resonance Contrast Agent for Delayed Tumor Imaging In Vivo. Zheng Huang, Yinxing Miao, Chunmei Lu, Jiewei Luo, Yan Zhang, and Deju Ye. Angew. Chem. Int. Ed. 2025,e16998. doi.org/10.1002/anie.202516998
