内容提要
本文报道了一种可活化的荧光/光声(PA)探针(CDIA)的设计和合成，用于AKI中•OH的敏感和选择性成像。CDIA具有近红外荧光/PA通道和快速的激活动力学，能够在AKI模型中检测到•OH的发作。我们还建立了一种利用CDIA对草药中天然•OH抑制剂进行HTS的方法。通过激活Sirt1/Nrf2/Keap1信号通路筛选出葛根素，保护AKI中的肾细胞。
实验结果与讨论
CDIA的合成与光谱响应
CDIA的构建主要包括三个步骤:i)对称菁染料1 (CyCl)的合成，ii)半菁前体2 (CyOH)的合成，以及iii) CyOH与3,5-二碘水杨酸偶联合成探针CDIA。半花青碱前体CyOH以对称的花青碱染料CyCl和间苯二酚为原料，通过逆knoevenagel反应，与3,5-二碘水杨酸反应得到半花青碱CDIA。
为了确定CDIA对•OH的响应，利用光谱分析定性和定量地跟踪探针的变化。最初，CDIA是非荧光的，在650 nm处有一个NIR吸收峰。在37°C下暴露于•OH后，探针在650 nm处的吸收峰显著下降，在690 nm处出现了一个新的吸收峰，对应于游离染料CyOH。此外，CDIA显示720 nm处荧光强度增加和与•OH反应后荧光量子产率上升到0.27。这是由于•OH和碘水杨酸之间的有效反应酸性亚基，导致CyOH部分与荧光团的强给电子酚基团形成，从而产生强荧光。观察到荧光强度与•OH浓度之间具有良好的线性关系，检测限(LOD)为5.30 nm，表明其对•OH与其他先前报道的工作进行比较。该探针对Fenton试剂表现出显著的灵敏度和快速响应，在3分钟内完成氧化。此外，CDIA对其他干扰物(包括其他ROS和金属离子)的NIR荧光响应可以忽略不计，表明其NIR激活通道对•OH具有高特异性。探针在6.0-9.0的生理pH范围内功能良好，并表现出优异的稳定性，表明其在活生物体中检测•OH的潜力。对CDIA的PA特性也进行了研究，在存在•OH的情况下，探针在690 nm处的PA信号显著增加，这与经过•OH处理后的吸收变化一致。结果表明，CDIA具有良好的光活化性能，可用于体外检测•OH。
CDIA对活细胞中•OH动态变化的近红外荧光响应
HK-2细胞(来自正常成人肾脏的永生化近端小管上皮细胞系)被给予肾毒性药物顺铂(顺-二胺铂二氯化，CDDP)一半最大抑制浓度(IC50)定义为诱导凋亡百分比达到50%所需的浓度。CDDP在相应的IC50下分别处理HK-2细胞24 h。在对照组中，HK-2细胞在处理CDDP之前预先加载10 mm硫脲(一种公认的OH清除剂)2小时。然后用CDIA (10 μm)孵育各组，进行NIR荧光成像。孵育30 min后，cddp处理的HK-2细胞NIR荧光明显增强22.97倍，证实了CDIA用于药物性细胞损伤成像的可行性。共染色实验表明，•OH激活后，CDIA主要定位于线粒体区域。这一发现与之前的研究一致，在这些研究中，阳离子荧光探针，如花青素染料，被发现在活细胞的线粒体内表现出选择性积累。相反，经硫脲预处理的HK-2细胞荧光强度明显降低，进一步验证了HK-2细胞中过表达的•OH激活后的荧光扩增源于CDIA。同时，使用CDIA监测细胞内•OH -随时间的变化，没有发现光活化或光漂白的证据。为了在广泛的背景下检测内源性•OH，我们研究了CDIA在各种模型细胞中的使用。具体来说，我们通过PMA(一种诱导内源性OH的蛋白激酶C (PKC)激活剂)处理RAW264.7小鼠巨噬细胞和HeLa细胞来评估其性能。细胞与PMA(浓度为200或500/ng mL)共孵育4小时，然后与10 μm CDIA在37°C孵育30分钟。结果显示，与对照组相比，NIR荧光信号显著增加。此外，我们测试了CDIA检测对乙酰氨基酚(APAP)引起的HepG2细胞OS的有效性，对乙酰氨基酚是许多感冒药的成分，过量服用可能导致肝损伤和OS。结果显示，不同浓度的APAP使NIR荧光信号呈剂量依赖性增加。这些发现表明CDIA是一种非常有效的细胞内•OH成像工具。
天然产物的高通量筛选
我们继续研究其作为识别可减少•OH形成的抗氧化剂的筛选工具的潜力。为此，我们利用CDIA@LMWC NP技术建立了一个简单有效的HTS平台。具体来说，在给药75 μm CDDP 24 h之前，用50 μm具有潜在抗氧化活性的各种天然产物对HK-2细胞进行预处理12 h。随后，用20 μg mL−1 CDIA@LMWC NP处理细胞后，对内源性•OH水平进行图像和定量分析。
利用这种方法，可以保证内源性•OH生成的快速定量检测。我们的研究结果表明，选择的部分天然产物能够显著减少荧光信号，表明•OH生成的下调。特别值得注意的是，葛根素(Pue)，一种在草药葛根中发现的关键活性成分，被证明在减少荧光信号方面与未经处理的对照相比非常有效。这一现象表明，这种类黄酮化合物可能有潜力作为一种控制活细胞中肾毒性药物产生的•OH -积累的药物。结果表明，CDIA@LMWC NP可以作为一种有价值的工具，以一种简单而有效的方式筛选调节内源性•OH变化的天然化合物。大多数用于活性测定和筛选生物分子的试剂盒都是基于设计的显色试剂在特定波长的光密度(OD)值工作的。在这里，为了实现更高的便携性和效率，我们使用了具有高灵敏度的CDIA@LMWC NP来检测•OH含量，并建立了HTS系统来快速发现天然产物以衰减AKI。在这项工作中，从天然化合物库中提取了50种具有多种化学骨架的天然化合物(如香豆素、倍半萜、单萜、二萜、三萜、黄酮类、类固醇、生物碱、多酚和醌类)，评估了它们对AKI的抗氧化作用。与对照组相比，CDIA化合物J9(绿原酸)、K10(槲皮素、Que)和K11(葛根素、Pue)对应的孔在690/650 nm处的吸收强度比较弱(A690/A650)，表明CDIA具有潜在的•OH清除作用。与对照组相比，每口井的相对A690/A650的直观解释。由于绿原酸和Que清除•OH的作用已经被一些先前的研究清楚地证明，化合物K11 (Pue)被选择作为一种潜在的治疗药物来减轻AKI。
AKI的体内双工成像
CDIA在PBS和尿液中的荧光几乎相同，表明CDIA在小鼠体内具有良好的稳定性。此外，在小鼠中证实CDIA和CDIA@LMWC NP没有急性或慢性毒性，对红细胞的溶血毒性可以忽略不计，表明CDIA@LMWC NP在体内应用的潜力，特别是在监测肾脏疾病方面。为了探讨CDIA@LMWC NP的药代动力学，采用高效液相色谱法检测了CDIA@LMWC NP在活体小鼠单独静脉注射后的血药浓度。血液浓度曲线显示CDIA@LMWC NP的体内动力学呈双室模式。计算出CDIA@LMWC NP血药浓度的消除半衰期(t1/2时延)为65.35 min，强调其通过全身清除有效地从体内清除。利用CDDP(一种已知的肾毒性癌症治疗药物)作为模型药物，在小鼠模型中评估CDIA@LMWCNP对AKI双相成像的能力本实验采用随机分配的方法将小鼠分为5组，其中1组为生理盐水对照组，4组为CDDP总剂量相同但给药频率不同的治疗组。CDDP给药后静脉注射CDIA@LMWC NP，在NIR窗内以不同的时间间隔对小鼠进行体内成像。同时，使用经尿道导管收集小鼠的尿液样本，随后在650 nm照射下对其进行成像。给予高初始剂量CDDP的小鼠在12小时后表现出肾脏损伤的迹象。随着时间的推移，肾脏中NIR荧光信号和PA强度逐渐增加，这表明肾脏损伤从轻度进展到重度。接受低初始剂量CDDP治疗的IV组出现迟发性肾功能障碍，而重复剂量的CDDP也导致肾脏损害。小鼠尿液的荧光信号变化与体内NIR荧光观察到的相似。而NIR荧光和肾内PA的振幅表明随着时间的推移肾脏损伤的状态，尿液信号表明短暂性肾损伤的程度。肾切片的病理分析进一步验证了上述发现。值得注意的是，使用双模成像方法监测肾功能障碍，可以根据BUN和sCr水平在临床诊断前36小时识别cddp引起的肾损伤，为AKI诊断提供了额外的信心。以lmwc为目标的肾脏监测方法有助于及时发现肾脏疾病，并提供治疗期间肾损伤演变的宝贵信息，这可能有助于优化治疗。
结论
我们已经创建了一种探针，可以通过激活NIR荧光和PA信号来响应•OH来检测AKI。该双模成像探针包括NIR半花青碱染料(CyOH)与•oh响应底物碘水杨酸偶联。CDIA对•OH具有高的敏感性和特异性，具有快速的活化动力学和高的生物相容性。引入LMWC增强肾脏靶向性后，CDIA@LMWC NP在肾脏内蓄积，无需任何主动干预，触发其荧光和PA信号，指示AKI相关OS的表达水平。在包括BUN和sCr检测在内的典型临床检测中，使用该探针的12 h阳性时间优于48 h。此外，CDIA@LMWC NP对草药中天然•OH清除剂的HTS表现出出色的能力，揭示了天然产物减轻AKI的化学调节中的其他机制。进一步的研究表明，通过筛选选择的天然抗氧化药物Pue通过分解cdp诱导的OH来保护AKI病例中的肾细胞。此外，它激活Sirt1/Nrf2/Keap1信号通路来调节ros相关基因，从而恢复肾细胞的氧化还原稳态。鉴于其制备简单，反应活性随情况而定，我们预测双成像探针CDIA可能成为检测临床AKI和其他ros相关疾病的潜在选择，从而阐明ros相关病理过程，提高整体诊断效能。
参考文献
Illumination of Hydroxyl Radical in Kidney Injury and High-Throughput Screening of Natural Protectants Using a Fluorescent/Photoacoustic Probe,Han Gao, Lei Sun, Jiwei Li, Qilin Zhou, Haijun Xu,* Xiao-Nan Ma, Renshi Li,* Bo-Yang Yu, and Jiangwei Tian*,Adv. Sci. 2023, 10, 2303926, DOI:10.1002/advs.202303926
