内容提要
本文献报道了癌症中免疫检查点的生物正交反应荧光开启检测。该方法涉及生物正交可激活的近红外荧光探针（BAP）和反环辛烯（TCO）标记的免疫检查点抗体（PDL1TCO）。BAP 是一种半花青荧光团，其羟基被四嗪笼住。与PDL1TCO 的 TCO 反应后，BAP 的四嗪部分被裂解，释放出未锁定的半花青，并产生荧光开启响应。BAP 不仅可以特异性检测和追踪小鼠结肠癌模型在治疗过程中 PDL1 表达水平的波动，而且还表现出比“始终开启”荧光团偶联抗体更高的信号背景比，以及比活检肿瘤组织的流式细胞术分析更高的检测灵敏度。
实验结果与讨论
TCOs 缀合的PDL1（PDL1TCO）首先通过 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯法通过共价键构建共轭将 PDL1 在其赖氨酸残基的胺基上与反应性 TCO（TCO-PEG4-NHS 酯）结合，然后通过脱盐柱进行后续纯化。每个 PDL1 有约 10 个 TCO 部分。 通过竞争性 PDL1 酶联免疫吸附测定 (ELISA) 评估了PDL1TCO 对 PDL1 的结合亲和力，显示半最大有效浓度 (EC50) 为 2.66 nm，与未修饰的 PDL1 (2.38 nm) 相似。 这证实 TCO 的存在几乎不会改变其结合亲和力。 BAP 被合理设计为模型探针，包含三个组件：水溶性部分聚乙二醇 (PEG)、信号部分半花青荧光团 (CyOH) 和生物正交部分四嗪。BAP 的合成从近红外 CyOH 开始。首先，CyOH 的羟基被 N-Boc-N,N'-二甲基乙二胺笼住，然后用三氟乙酸对 Boc 进行脱保护，得到化合物 2。接下来，具有反应性酯部分 (Tz-NHS) 的 1,2,4,5-四嗪通过 NHS 缀合与化合物 2 缀合，得到 CyTz。 最后，亲水性 PEG 链通过点击反应进一步与 CyTz 缀合，得到 BAP。为了测试 BAP 的光学特性和传感能力，在存在或不存在 PDL1TCO 的情况下研究了吸收光谱和荧光光谱。BAP 在 600 和 646 nm 处显示出两个特征紫外 (UV) 吸收峰，并且最初在 pH 7.4 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中不发出荧光。添加PDL1TCO后，IEDDA反应恰好裂解四嗪部分，释放出未封闭的PEG缀合半花青（CyOHP），导致在694 nm处出现相应的吸收峰，并在720 nm处出现25倍近红外荧光（NIRF）增强。 动态监测表明，BAP 和 PDL1TCO 之间的反应在 4 小时内达到平台，释放半衰期小于 1 小时，足以满足体内应用。 在 BAP 浓度恒定时，NIRF 强度随着 PDL1TCO 的浓度逐渐增加，表现出很强的线性关系（0-62.5 nm），检测限（LOD）低至 3.48 nm。 同样，在 PDL1TCO 浓度恒定时，观察到 NIRF 强度与 BAP 浓度之间呈正线性关系。 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高效液相色谱 (HPLC)分析验证了荧光开启和通过 IEDDA 裂解从 BAP 中释放未捕获的 CyOHP，证实了在 PDL1TCO 存在的情况下 BAP 转化为 CyOHP。相应的产物峰通过 MOLDI-TOF 质谱进一步验证。
BAP/PDL1TCO 对用于对活癌细胞上的 PDL1 表达进行成像。荧光和 HPLC 分析证实，BAP 在生理条件下具有高稳定性，因为在 PBS 缓冲液中 37 °C 孵育 24 小时后，其激活率仅低于 6%。在孵育 24 小时后，BAP 在小鼠结肠癌细胞系 (CT26) 中也显示出可忽略不计的细胞毒性。 据报道，基于顺铂的化疗可以增加癌细胞中PDL1的表达，因此选择0、10和20μm浓度的顺铂治疗CT26细胞。 用 PDL1TCO (0.4 μm) 预处理并用 BAP (4 μm) 孵育后，进行共聚焦和 IVIS 成像实验。BAP/PDL1TCO 系统的荧光信号源自四嗪笼中的 BAP 和 PDL1TCO 上的 TCO 部分之间的生物正交 IEDDA 反应，这些部分与细胞表面表达的 PDL1 预先结合。 反应后，四嗪基团被裂解，导致荧光激活并释放 BAP 中的半花青荧光团。 细胞摄取的活化 BAP 和上清液中的残留部分均进行了研究。 用 10 和 20 μm 顺铂治疗后，通过共焦成像测量的细胞 NIRF 信号分别增加了 1.3 和 2.3 倍； 而上清液 NIRF 信号分别增强 1.8 倍和 3.7 倍。 这与通过 IVIS 成像测量的细胞和上清液的总 NIRF 信号一致，显示用 10 和 20 μm顺铂处理后分别增加了 2.6 倍和 5.0 倍。为了验证 BAP/PDL1TCO 对是否真正反映了 PDL1 表达水平，使用 PDL1 结合 Alexa Fluor 488 (AF488) 标记的二抗进行流式细胞术。尽管 BAP/PDL1TCO 成像和PDL1-AF488 流式细胞术在灵敏度、定量和空间分辨率方面有所不同，但两者都使用相同的抗体并识别相同的靶标。 尽管存在这些差异，经顺铂处理的活化 BAP 细胞的总荧光强度与其基于流式细胞术的结果呈正相关，相关系数为 0.96，皮尔逊指数为 0.98。 然而，BAP/PDL1TCO 对的信号增强倍数分别比用 10 μm 和 20 μm 顺铂处理后流式细胞术测量的信号增强倍数高 1.7 倍和 2.6 倍。因此，这些数据证明了生物正交对（BAP/PDL1TCO）用于检测PDL1表达的特异性和高灵敏度。
在-PDL1存在或不存在的情况下，BaP在血浆中的消除半衰期较短(≈8min)，表现出与CyOHP相似的药代动力学行为。为了确定BAP的肾脏清除率和体内稳定性，我们采集了活体小鼠的尿样，并用高效液相色谱法进行了定量。由于其高亲水性和低分子量，BAP表现出高效和快速的肾脏清除，在注射后24小时内清除总剂量的72%(P.I.)。此外，组织学分析显示，BAP和BAP/PDL1TCO对在活体动物中没有组织损伤。通过实时成像和光学尿液分析，利用BAP/CT26PDL1TCO对结直肠癌荷瘤小鼠体内检测了PDL1的表达。在顺铂治疗后，将BAPPDL1TCO静脉注射到活体小鼠体内，以预靶向12h(Pre-12)、24h(Pre-24)和48h(Pre-48h)，然后静脉注射进行纵向成像。在没有PDL1TCO预靶向的生理盐水组中，观察到可以忽略不计的NIRF信号，这表明由于BAPPDL1TCO的高稳定性，其激活程度最低。与之相反，BAPPDL1TCO预靶向组肿瘤部位信号逐渐增强，-PDL1注射后6~8h达高峰。此外，在各个成像时间点，Pre-24组小鼠肿瘤内BAP信号均高于其他组。Pre-24组小鼠注射BAP后6h的最大NIRF信号分别是对照组(生理盐水处理组)、Pre-12组和Pre-48组的4.8、1.3和1.4倍。来自不同组的肿瘤和肾脏的体外近红外成像显示出相似的趋势。但是，脾和肝脏的信号比肿瘤的≈低10.0倍和3.0倍，证明这些器官中只有少量 BAP 积聚并被激活。 BAP 的这种背景信号可能是由于 PDL1TCO 与脾脏和肝脏免疫细胞上表达的 PDL1 结合而激活的。通过检测12h内尿液中BAP的荧光信号，确定BAP/PDL1TCO对尿液中PDL1表达的检测能力。与生理盐水组相比，Pre-12、Pre-24和Pre-48组的尿中NIRF信号分别增强了3.0倍、3.7倍和2.6倍。这些尿液信号与体内成像数据很好地吻合，证明了BAP/PDL1TCO对对活体小鼠肿瘤中PDL1表达的非侵入性尿液分析的潜力。
为了测试其监测治疗后PDL1表达水平变化的能力，将PDL1TCO静脉注射到接受不同剂量顺铂的小鼠体内，对PDL1进行预靶向24小时，并在静脉注射BAP后进行纵向成像。实时成像显示，所有组的 NIFR 信号随时间的变化曲线保持相似，并在注射 BAP 后 6 小时达到峰值。在每个时间点，肿瘤中的信号随着治疗剂量的增加而增加。接受一剂和两剂顺铂后肿瘤中的最大信号分别比未治疗的小鼠高 1.9 倍和 2.9 倍。与实时成像数据一致，相对于未治疗的小鼠，在接受顺铂治疗的小鼠的肿瘤组织切片中检测到更强的信号。研究了 BAP/PDL1TCO 对尿液分析响应不同剂量的 PDL1 表达水平变化的能力。一剂和两剂顺铂的尿液信号分别比未治疗小鼠高 1.6 倍和 2.4 倍。为了检查 BAP/PDL1TCO 对是否反映了肿瘤 PDL1 的表达，使用PDL1 结合 AF488 标记的二抗进行流式细胞术。 AF488 标记二抗的信号与肿瘤和尿中 BAP 的信号相关。 然而，在两次剂量的顺铂治疗后，BAP/PDL1TCO 对的信号增强倍数分别比肿瘤组织和尿液中基于流式细胞术的结果高 1.5 倍和 1.2 倍。 这些数据证实BAP/PDL1TCO对可用于治疗过程中PDL1表达的无创实时监测和尿液分析，并且比流式细胞术更灵敏。
对 BAP/PDL1TCO 对 PDL1 免疫染色的检测能力进行了评估，并与经典 PDL1 免疫染色的检测能力进行了比较。 我们首先通过经典方法的共免疫染色证实了 BAP/PDL1TCO 对用于 PDL1 检测的可行性和准确性。 与涉及两个洗涤步骤的经典免疫染色相比，生物正交对免疫染色由于荧光开启响应而避免了二次洗涤步骤。两种方法在化疗后与 PDL1 表达水平相对应的信号中显示出相似的趋势。然而，与经典免疫染色相比，生物正交对免疫染色的荧光信号在每个信号点都有显着增强。这是因为每个 PDL1TCO 中有 10 个 TCO 可以与 BAP 发生反应，从而放大每个 PDL1 蛋白的信号。为了量化 PDL1 表达，生成了免疫染色图像的荧光强度分布。对于 0、1 和 2 剂量的顺铂治疗，基于 BAP/PDL1TCO 对的免疫染色的荧光强度曲线的曲线下面积 (AUC) 分别为 2.1、4.0 和 7.5，分别比经典 PDL1 免疫染色高 2.5、1.9 和 2.3 倍。 线性回归分析显示生物正交对免疫染色和经典 PDL1 免疫染色的 AUC 值之间存在很强的正相关性。 因此，这些结果验证了生物正交对免疫染色不仅避免了二次洗涤步骤，而且对 PDL1 具有较高的检测特异性和敏感性。
结论
我们报道了一种生物正交可激活的荧光开启方法，用于检测癌症中的免疫检查点蛋白。 该方法包含生物正交对（BAP 和PDL1TCO）来检测体外和体内 PDL1 的表达。 与 PDL1TCO 上标记的 TCO 发生反应后，BAP 的四嗪部分可以被裂解，释放出未封闭的半花青，并产生荧光开启响应，导致溶液和癌细胞中的 NIRF 信号分别增加 25 倍和 5 倍。 生物正交对的荧光开启响应不仅能够特异性检测和跟踪治疗期间小鼠结肠癌模型中 PDL1 表达水平的波动，而且相对于“始终开启”的PDL1cy，其 SBR 提高了 4.5 倍。 与流式细胞术测量的肿瘤 PDL1 水平的强信号相关性证实了这一对的高特异性和敏感性。 此外，BAP 的快速肾清除效率使得可以方便地进行 PDL1 表达的尿液分析，而生物正交激活的荧光促进了肿瘤切片的离体免疫染色，无需二次洗涤。
参考文献
Near‐Infrared Bioorthogonally Activatable Fluorescence Probe for In Vivo Imaging of Immune Checkpoint in Cancer,Jing Liu, Si Si Liew, Penghui Cheng, Xinzhu Wang, Donghao Li, Xin Wei, Yuxuan Hu, and Kanyi Pu. Adv. Funct. Mat., 2025, 35, 2508396. https://doi.org/10.1002/adfm.202508396
