内容提要
本研究探讨了一种发射波长位于近红外二区（NIR-II）窗口的半乳糖靶向纳米荧光探针（Gal-OH-BDP NPs，简称 GOB NPs）在动物模型原位肝细胞癌荧光成像中的可行性。通过脂肪乳剂（Intralipid）和鸡胸肉进行体外成像实验，评估 GOB NPs 与吲哚菁绿（ICG）在近红外（NIR）窗口的组织穿透深度；在原位肝肿瘤动物模型中开展在体近红外一区 / 二区（NIR-I/II）成像。瘤内注射 GOB NPs 后，探针可在肝癌组织中靶向聚集。定量图像分析显示，GOB NPs 介导的 NIR-II 成像在肿瘤部位荧光强度最高，且肝脏背景荧光最低，因此获得了最高的肿瘤 - 正常肝组织信号比（TNR）和最优的肿瘤切缘分辨率。静脉注射 GOB NPs 后，探针呈现 “负染色” 效应，可清晰勾勒肿瘤边界，实现肿瘤与肝组织的高对比度成像。
实验结果与讨论
毛细管体外荧光成像
在无 Intralipid 溶液环境下，NIR-II 窗口下检测含 GOB NPs 水溶液的毛细管，其半高全宽（FWHM）值为 522.90±2.64 μm；含 ICG 水溶液的毛细管在 NIR-I 和 NIR-II 窗口下的 FWHM 值分别为 557.60±16.22 μm 和 525.40±9.17 μm，均能清晰显示毛细管轮廓。随着浸泡深度增加，组织吸收和散射效应逐渐显现：NIR-II 窗口下，GOB NPs 水溶液毛细管在 2、5、8、11 mm 浸泡深度下的 FWHM 值分别为 1672.66±34.52 μm、2496.64±25.82 μm、3815.70±169.12 μm、5159.43±59.13 μm，8 mm 深度下仍可辨认毛细管轮廓；ICG 水溶液毛细管在 NIR-II 窗口下相同深度的 FWHM 值分别为 2277.49±63.38 μm、3443.93±34.99 μm、4919.09±115.64 μm、5218.40±28.74 μm，最大可分辨深度为 5 mm；ICG 水溶液毛细管在 NIR-I 窗口下相同深度的 FWHM 值分别为 4990.79±61.34 μm、5228.48±66.10 μm、5275.77±57.70 μm、5252.94±81.65 μm，2 mm 深度下荧光图像清晰度显著下降，几乎无法分辨。
原位肝细胞癌在体荧光成像
ICG 静脉注射 72 小时后获取 NIR-I/II 图像，GOB NPs 瘤内注射后获取 NIR-II 图像。对肿瘤近红外荧光图像进行定量分析，以 TNR 指数量化肿瘤与正常肝组织的视觉对比度。在无鸡胸肉组织覆盖的情况下，三组间 TNR 存在统计学显著差异（F=48.945，p<0.001），NIR-II GOB 组（TNR=5.12±1.06，n=10）显著高于 NIR-II ICG 组（TNR=3.03±0.68，n=10；平均差值 = 2.10，95% CI [1.25, 2.94]，p<0.001）和 NIR-I ICG 组（TNR=1.80±0.38，n=10；平均差值 = 3.32，95% CI [2.47, 4.16]，p<0.001），且 NIR-II ICG 组显著优于 NIR-I ICG 组（平均差值 = 1.22，95% CI [0.38, 2.06]，p<0.01）。对 TNR 的三个组成部分（肿瘤部位荧光强度、正常肝组织背景荧光强度、环境背景荧光强度）进行亚组分析，肿瘤区域荧光强度方面，NIR-II GOB 组（224.31±6.41）高于 NIR-II ICG 组（203.71±14.88）和 NIR-I ICG 组（146.56±33.48），组间差异有统计学意义（F=35.188，p<0.001）；正常肝组织背景荧光强度方面，NIR-I ICG 组最高（88.83±24.76），NIR-II GOB 组（45.94±7.68）显著低于 NIR-II ICG 组（70.01±12.13）（平均差值 =-24.07，95% CI [-42.40, -5.75]，p<0.01），组间差异有统计学意义（F=16.923，p<0.001）；环境背景荧光强度方面，使用相同成像设备和激发条件时，NIR-II GOB 组（0.88±0.44）与 NIR-II ICG 组（0.54±0.26）无统计学显著差异（平均差值 = 0.34，95% CI [-0.01, 0.68]，t=2.055，p>0.05），而 NIR-I ICG 组因单区成像设备缺乏滤光片且成像窗口波长较短，环境背景荧光强度更高（11.11±5.07），与 NIR-II GOB 组（平均差值 = 10.23，95% CI [6.85, 13.61]，t=6.358，p<0.001）和 NIR-II ICG 组（平均差值 = 10.57，95% CI [7.19, 13.94]，t=6.583，p<0.001）均存在显著差异。
荧光图像肿瘤边缘分辨率比较
通过计算肿瘤边缘像素的灰度值变化率量化肿瘤边缘分辨率。分析显示，NIR-II GOB 组灰度值变化率最高（160.11±23.31，n=10），显著高于 NIR-II ICG 组（101.17±18.29，n=10；平均差值 = 58.94，95% CI [39.33, 78.54]，p<0.001）和 NIR-I ICG 组（36.83±7.76；平均差值 = 123.27，95% CI [103.67, 142.89]，p<0.001），组间差异有统计学意义（F=121.572，p<0.001）。
在使用相同成像设备和激发条件的两组中，与 NIR-II ICG 组相比，NIR-II GOB 组肿瘤部位荧光强度更高（253.48±12.93 vs 218.10±22.14，平均差值 = 35.39，95% CI [18.36, 52.42]，t=4.365，p<0.001），邻近肝组织背景荧光强度更低（93.37±15.62 vs 116.92±12.57，平均差值 =-23.55，95% CI [-36.86, -10.23]，t=-3.715，p<0.01）。
GOB NPs 静脉注射对原位肝细胞癌的 “负染色” 成像
观察 GOB NPs 静脉注射后在正常肝实质和肝癌组织中的摄取情况。注射后 24 小时的成像结果显示，肝肿瘤呈现 “负染色” 模式 —— 肿瘤部位无荧光，而正常肝实质出现强荧光信号，形成清晰视觉对比。这种对比在伴肝内转移的大肝癌和小肝癌中均十分明显。定量分析显示，肝 - 肿瘤对比度达 2.33±0.56（n=3）。对 NIR-II 荧光信号边界附近高荧光区域和低荧光区域的病理分析证实，GOB NPs 静脉注射产生的 “负染色” 图像可有效区分肿瘤与正常肝实质，并精准指示肿瘤边缘。
结论
本研究通过瘤内注射 GOB NPs，成功实现了原位肝细胞癌的高质量近红外二区（NIR-II）荧光成像。与吲哚菁绿（ICG）介导的近红外一区 / 二区（NIR-I/NIR-II）成像相比，该方法展现出更优异的肿瘤 - 正常肝组织信号比（TNR）、肿瘤边缘分辨率和成像深度，从而能够更精准地勾勒肿瘤边界。此外，静脉注射方式可利用肝脏代谢特性产生负对比效应，用于检测转移灶。这种双成像功能的结合，提供了一种可定制、多功能的术中导航策略。通过精准界定肿瘤边缘，协助外科医生在完整切除肿瘤的同时保留健康肝实质，该系统可显著降低术后复发风险并延长患者生存期。
参考文献
Precision Visualization of Surgical Margins and Depth Imaging Performance in Orthotopic Hepatocellular Carcinoma Using Galactose-Targeted NIR-II Fluorescence Nanoprobe, Zihao Liu, Taofei Zeng, Huiping Dang, Hao He, Jingfei Li, Lifeng Yan,* and Dalong Yin*, Anal. Chem. 2025, 97, 16619−16627, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c02961
