内容提要
本研究报道了一种新的串联检测分子探针(HCys)，用于检测AD过程中的两个关键病理标志物，即丁酰胆碱酯酶(BChE)和β-淀粉样蛋白(A β)。探针经过bche特异性酯酶水解，导致荧光增强48倍。水解后形成的探针可进一步与A β聚集体结合，触发6-7倍荧光增强，建立了“酶激活”级联检测机制。在离体脑组织实验中，该探针成功地可视化了AD小鼠大脑中BChE的空间分布，并且水解探针特异性标记了AD小鼠大脑中的A β斑块。
实验结果讨论
本文拟从提高探针对BChE的特异性识别能力和提高探针分子对A β聚集体的响应两方面同时构建近红外区域(NIR)荧光分子探针框架。鉴于供体-π-受体(D-π-A)结构可以保证分子在NIR波段的荧光发射，我们基于半菁氨酸结构构建了分子体系。在半花青素分子体系中，碘化甲基吲哚花青素是常用的电子受体。共轭体系由烯烃结构组成，我们在其上加入噻吩以协同起作用。同时，羧酸环丙烷可以作为BChE的结合基。环丙烷羧酸酯的结构尺寸与BChE的结合袋高度相容。在环丙烷羧酸酯解离后，羟基可以作为给电子基团，最终构建D-π-A结构。以2,3,3 -三甲基- 3h -吲哚为原料，通过曼尼希反应得到化合物1(产率78%)和化合物2(产率75%)。然后，用4-羟基苯硼酸和5-溴噻吩-2-乙醛进行Suzuki反应得到化合物3(产率67%)。化合物1和化合物2分别与化合物3进行Knoevenagel缩合反应，得到HMy-OH(40%产率)和HEy-OH(40%产率)。最后，HMy-OH和HEy-OH与环丙基羰基氯进行亲核加成反应，分别得到HCy-Me(75%收率)和HCy-Et(75%收率)探针。PBS溶液中的HCy-Me和HCy-Et探针颜色均为浅黄色，在475 nm处(ε = 1.26×10-4M−1cm−1)和480 nm处(ε=1.05×10-4M−1cm−1))表现出较强的吸收峰。经过BChE的催化作用，两种溶液的颜色都由淡黄色变为红色。吸收光谱发生了色移和增强，分别达到515 nm(HMy-OH， ε = 4.68×10-4M−1cm−1))和520 nm (HEy-OH，ε=4.04×10-4M−1cm−1)。当探针以最大吸收波长激发时，发射光谱分别位于647 nm、622 nm、652 nm和653 nm，分别产生172nm、142 nm、137 nm和133 nm的Stokes位移。随后被BChE水解导致荧光强度显著增强。苯酚基的形成产生了一个供体结构，并伴有深色偏移发射。探针形成典型的“off-on”型探针。荧光量子产率(以罗丹明B为参比)从0.0133% (HCy-Me)和0.0098%(HCy-Et)提高到0.0765% (HMy-OH)和0.0525% (HEy-OH)。HCy-Me和HCy-Et较低的qy是由于引入了环丙基羰基，形成了一个柔性的酯键。我们选择了五种极性不同的溶剂，并对所有探针进行了吸收和荧光光谱测试。结果显示，随着溶剂极性的逐渐增加，化合物的荧光发射波长出现了明显的红移，这表明了显著的溶剂致变色效应。有报道称，淀粉样蛋白-β(A β)从单体到原纤维的聚集过程导致局部的黏度显著增加。因此，我们在甘油-水体系中测试了探针对粘度的敏感性。随着甘油比例的增加，探针的荧光强度也相应增加。这是因为增加的粘度增强了分子转子的荧光信号。研究了HCy-Me和HCy-Et的亲脂性。导致Log P差异的因素与分子本身的大小、偶极矩和溶剂中的离子强度有关。HCy-Me和HCy-Et都具有碘化吲哚菁结构，并带正电荷，因此这部分相对亲水。而共轭体系和环丙基则是相当亲脂的。两亲分子促进分子通过BBB。为了评估HCy-Me和HCy-Et探针是否能灵敏地检测BChE，我们进行了荧光滴定实验。随着BChE浓度从0逐渐增加到1.6 U/mL,HCy-Me和HCy-Et在640 nm处的荧光强度逐Talanta 300 (2026) 129169渐增加(HCy-Me为48倍，HCy-Et为40倍)，并伴有约50 nm的红移，同时，探针的荧光强度与BChE浓度呈良好的线性关系。HCy-Me对BChE的检出限(LOD)仅为0.0086 U/mL, HCy-Et对BChE的检出限为0.010 U/mL。以上结果表明，HCy-Me和HCy-Et能够准确识别BChE。此外，两种探针对金属离子(K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+)、氨基酸(Ser、Lys、Arg、GSH、甘氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、Ala)、牛血清蛋白(BSA)和人血清蛋白(HSA)、胃蛋白酶、AChE和A β42聚体。然而HCy-Et显示BSA的轻微增强(7倍)。因此，HCy-Me对BChE具有较好的选择性。
高结合亲和力
结合常数(Kd)是分子间相互作用的重要指标，反映了探针与靶酶结合的能力。评估了HCy-Me和HCy-Et对BChE的结合亲和力。使用GraphPad Prism 10软件进行非线性拟合分析。分析结果表明，HCy-Me和HCy-Et与BChE的解离常数(Kd)分别为40.32 μM和35.83 μM。重要的是，这些实验结果与通过分子对接模拟得到的结果一致。一致性验证了HCy-Me比HCy-Et对BChE具有更强的结合亲和力。接下来，为了评估探针的实时检测能力，我们进一步研究了探针与BChE (1 U/mL)孵育期间荧光强度的动态变化。在加入BChE后，HCy-Me和HCy-Et探针的荧光信号在5min内迅速增强，随后HCy-Me荧光信号增加较慢，在40 min时达到稳定水平，HCy-Et在35 min时稳定。接下来，进行荧光滴定实验，评价水解探针HMy-OH和HEy-OH是否能灵敏地检测A β42聚集体。随着A β42聚集体浓度逐渐增加(0 ~ 10 μM)， HMy-OH和HEy-OH在640 nm处的荧光强度均增加。HMy-OH和HEy-OH与A β42聚集体反应后，荧光强度分别提高了6倍和7倍。此外，HMy-OH和HEy-OH对Aβ 42聚集体的检出限分别为168.0 nM和280.8 nM。这证实了HMy-OH和HEy-OH对A β42聚集体的高敏感性。
细胞成像
为了探索探针在细胞内的安全性，我们使用MTT法测试了HCy-Me和HCy-Et对人胚胎肾细胞(293T)、大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞(PC12)和小鼠乳腺癌细胞(4T1)的细胞毒性。随着HCy-Me和HCy-Et探针浓度的增加，正常细胞的细胞存活率保持在80%以上，而当浓度达到32 μM时，癌细胞的存活率在70%以上。HCy-Me在正常细胞中表现出比HCy-Et更好的性能。总体而言，这两种探针都表现出较低的细胞毒性，表明它们适合进一步的体内研究。由于肝脏是BChE合成的主要器官之一，HepG2细胞保留了肝细胞的代谢功能，可以作为BChE高表达的模型。相比之下，293T细胞来源于肾脏，通常具有极低的BChE表达水平，可作为阴性对照。因此，两种细胞分别用HCy-Me和HCy-Et (10 μM)探针孵育15min, HepG2细胞用isoompa(一种bche特异性抑制剂)(20 μM)预处理2 h，然后用HCy-Me和HCy-Et (10 μM)分别孵育15 min作为对照组。且，它们可以作为A β42聚集体诊断的候选物。此外，当探针与其他潜在的竞争物质孵育时，添加不同的干扰物质会有轻微的波动。加入A β42低聚物和聚集体后，可水解探针HMy-OH和HEy-OH的荧光强度发生了显著变化。其中，HMy-OH对A β42聚集体表现出特别突出的选择性，荧光强度提高3.6倍，优于HEy-OH。这表明HMy-OH在检测A β42聚集体方面具有很大的潜力。
探针在HepG2细胞中均表现出明显的荧光信号，而在293T细胞中仅检测到微弱的荧光信号。此外，在iso-OMPA预处理的HepG2细胞中，所有探针都检测到非常微弱的荧光，表明探针选择性地靶向BChE。这些结果表明，HCys探针可以作为细胞内BChE的有效可视化工具，具有良好的靶向能力，可用于在细胞水平上跟踪BChE的分布。
小鼠体内荧光成像和离体脑匀浆分析
鉴于HCy-Me和HCy-Et在体外表现出优异的BChE跟踪能力，为了研究这两种探针是否可以穿过血脑屏障，我们进行了动物体内成像实验。选取8、12月龄AD模型小鼠和同龄WT小鼠。然后静脉注射HCy-Me和HCy-Et探针。8周龄小鼠模型注射HCy-Me和HCy-Et探针10 min后可检测到明显的脑荧光信号。其中，HCy-Me探针在AD小鼠模型中的荧光信号在2 h时达到最大值，然后逐渐降低;而WT小鼠的荧光信号无明显变化。在12月龄小鼠模型中，注射HCy-Me和HCy-Et探针约10 min后，也可在脑内检测到明显的荧光信号。在AD小鼠模型中，HCy-Me和HCy-Et探针的荧光信号在1 h时达到峰值。而WT小鼠的荧光信号无明显变化。此外，可以发现，探针在12月龄小鼠体内的荧光信号明显高于8周龄小鼠。因此，这些结果充分表明，HCys探针可以区分不同疾病阶段的AD小鼠。对于进一步比较，我们选择12月龄AD模型小鼠和同龄WT小鼠，分别通过尾静脉注射HMy-OH和HEy-OH探针。然而，他们都不能通过BBB。这些结果表明，环丙烷羧酸段可以显著增强探针穿过BBB的能力，这使得HCy-Me和HCy-Et在AD的精确诊断和病理研究领域具有潜在的应用价值。同时，环丙烷羧酸酯部分的引入显著增强了探针穿过BBB的能力，从而使其在AD的早期诊断和病理研究中具有潜在的应用价值。AD小鼠(12月龄，雄性)安乐死后，提取脑匀浆，并用探针孵育不同浓度(0-10 mg/mL)的脑匀浆。我们发现，随着脑匀浆浓度的增加，脑匀浆的荧光强度也随之增强。其中，在较低浓度(0-2 mg/mL)下，HCy-Me的荧光强度略高于HCy-Et，说明HCy-Me对脑匀浆中低浓度BChE更为敏感。当HCy-Me浓度达到8mg /mL左右时，荧光强度趋于饱和。总之，HCy-Me和HCy-Et在浓度范围(0-10 mg/mL)内保持良好的线性关系，具有更广阔的定量分析潜力。
总结
本研究成功构建了两个具有D-π-A结构的探针，实现了AD病理过程中BChE和a β斑块的特异性串联检测。在这些探针中，HCy-Me在化学稳定性、吸收系数和荧光量子产率方面都明显优于HCy-Et。荧光滴定实验证实，两种探针对BChE均有极好的选择性，其中HCy-Me灵敏度更突出，响应倍数为48倍(HCy-Et为40倍)。机理研究表明，探针被BChE识别后，会发生特异性酯酶水解反应，产生水解探针HMy-OH和HEy-OH。值得注意的是，水解探针可进一步特异性结合A β蛋白，并触发6-7倍荧光增强效应，从而建立了“酶活化”的串联检测机制。在离体脑组织实验中，HCy-Me和HCy-Et成功地可视化了APP/ PS1转基因小鼠脑组织中BChE的空间分布。同时，水解产物HMy-OH和HEy-OH可以特异性标记AD小鼠脑内的A β斑块。体内成像研究表明，尽管水解探针对BBB的穿透有限，但HCys对BChE具有出色的成像能力。注射HCys探针后，AD小鼠和野生型对照小鼠的大脑荧光强度有显著差异，可以成功区分早期(8周龄)和晚期(12月龄)AD模型。
参考文献
A novel enzyme-activated tandem fluorescent probe for dual detection of BChE and A β plaques in Alzheimer's disease, Shiyue Ji, Wenjing Wang, Sijie Ma, Peici Zhang, Zhenchang Xiang, Genyan Liu, Jun Wu, Kai Wang, Jie Pan, Talanta 300 (2026) 129169，https://doi.org/10.1016/j.talanta.2025.129169
