内容提要
具有聚集诱导发光（AIE）特性的近红外（NIR）荧光探针在生物医学成像中极具吸引力。粘度是反映微环境稳定性的关键参数，而异常的线粒体粘度与许多疾病和细胞功能障碍有关。因此，开发能够准确、实时监测线粒体粘度变化的新型近红外荧光探针具有重要意义。我们开发了三种基于香豆素-喹啉结构的近红外荧光探针（QI-1、QI-2、QI-3），采用供体-受体（D-π-A）设计。这些探针表现出强烈的分子内电荷转移（ICT）。与QI-2和QI-3相比，QI-1表现出卓越的性能，包括优异的聚集诱导发光（AIE）特性、大斯托克斯位移、高量子产率以及对黏度的高灵敏度。生物学研究证实QI-1能够选择性地定位在线粒体中，从而实现对细胞自噬过程中以及药物诱导（APAP）小鼠肝损伤模型中黏度变化的实时监测。本研究提出了一种合理且有效的设计策略，用于开发具有聚集诱导发光（AIE）特性的近红外荧光探针，专门用于感知微环境粘度。基于这一策略的探针能够实现对病理生理过程的非侵入性、高对比度可视化，适用于从亚细胞器到组织微环境的多尺度生物体系。这为先进的诊断方法以及对线粒体功能障碍相关疾病的机制性深入理解奠定了基础。
实验结果与讨论
探针的合成与光物理性质
碘喹啉（QI）通过 2-甲基喹啉与碘甲烷反应制备，产率为 50%。探针 QI-1-3 是通过 Knoevenagel 缩合反应制备的，将 QI 与相应的香豆素醛衍生物 Cou1、Cou2 和 Cou3 在哌啶存在下以乙腈为溶剂反应，产率分别为 30%、30% 和 35%。在25°C的DMSO中评估了探针 QI-1-3 的吸收和发射光谱。这些探针在光吸收方面表现出窄的吸收带，中心波长分别为QI-1的522 nm，QI-2的545 nm，以及QI-3的573 nm，摩尔消光系数（ε）均超过50000 M⁻¹ cm⁻¹。化合物的最大发射波长（λem）的顺序为QI-3>QI-2>QI-1。低能吸收带归因于从香豆素单元到QI单元的ICT（内电荷转移）π→π*跃迁。这些探针显示出宽的发射带，中心波长分别为QI-1的666 nm，QI-2的680 nm，以及QI-3的701 nm，对应于S1→S0跃迁。与QI-1和QI-2相比，QI-3在吸收和发射光谱中表现出显著的红移，这归因于茱洛啉基团比DPA和DEA基团具有更强的电子供给能力。相较于QI-2（3643 cm⁻¹）和QI-3（3187 cm⁻¹），QI-1观察到更大的斯托克斯位移（4142 cm⁻¹）。
AIE特性
为了探索这些染料是否具有聚集诱导发光（AIE）行为，研究了它们在甲苯和甲醇中的荧光发射特性。这些染料可溶于甲醇，但在甲苯中不溶。在纯甲醇中，所有探针的发射强度都非常低。然而，在甲苯中，QI-1表现出显著的荧光增强，这被归因于其在聚集状态下的AIE效应，而其他两种探针QI-2和QI-3则未观察到明显的发射增强。这些分子在纯甲苯中应该处于聚集状态。然而，所有化合物在甲苯中均均匀分散且没有沉淀，这表明形成了纳米级聚集体。QI-1的AIE效应应归因于通过聚集形成限制了N,N-二苯氨基的自由旋转。
为了进一步研究 QI-1 的聚集特性，在不同甲苯含量（体积比，f_tol）的甲苯/甲醇混合物中测定了其紫外-可见吸收和荧光发射光谱。随着甲苯含量从 0 增加到 99%，QI-1 的最大吸收波长从 520 nm 红移到 566 nm，同时吸收强度下降，这归因于 J 型聚集体的纳米颗粒形成及相关的光散射效应。此外，随着甲苯份额从 0（纯甲醇）增加到 99%，QI-1 的荧光强度逐渐增加，这可归因于甲醇溶液中稳定聚集体的逐步形成。QI-1 的荧光变化与相应的吸收变化高度一致，均证实在 99% 甲苯中存在聚集胶束。这一点通过动态光散射（DLS）表征得到证实，在甲苯中观察到平均直径约为 179 nm 的纳米颗粒。此外，还在不同甲苯含量（体积比，ftol）的甲苯/甲醇混合物中测定了 QI-2 和 QI-3 的紫外-可见吸收和荧光发射光谱。随着甲苯含量的增加，QI-2 的最大吸收波长从 541 nm 移动到 565 nm，而 QI-3 的最大吸收波长从 570 nm 移动到 598 nm，均表现出明显的红移。同时，它们的吸光度逐渐下降，这与 QI-1 观察到的聚集现象一致。然而，当甲苯比例从 0 增加到 60% 时，QI-2 和 QI-3 的荧光强度逐渐增加并达到最大值，这归因于聚集体形成限制了分子的旋转运动，显示出典型的 AIE 特性。这一趋势可归因于甲苯的溶剂效应增强了荧光，随后由于聚集加剧导致荧光猝灭。然而，QI-2 和 QI-3 的荧光强度随着甲苯体积分数从 60% 增加到 99% 而逐渐下降，这可能归因于 QI-2 和 QI-3 纳米颗粒的聚集。
对粘度的光谱响应
为了研究这些化合物对粘度的敏感性，分别在低粘度和高粘度条件下测量了它们的荧光发射光谱。在纯水中，所有探针都显示出非常微弱的荧光信号。然而，纯甘油的荧光强度显著增加。为进一步验证这些染料对粘度变化的荧光响应，测量了不同甘油/PBS缓冲液比例的发射光谱。当粘度（η）从1.01 cP（0%甘油）增加到1150 cP（99%甘油）时，荧光强度抑制了QI-1在655 nm处近42倍增强，QI-2在650 nm处增强90倍，QI-3在670 nm处增强30倍，相应的荧光量子产率为QI-1的0.02至0.32倍， QI-2从0.01降至0.21，QI-3从0.01降至0.23。这些结果表明，TICT可能发生荧光发射或非辐射去激发，具体取决于粘度。在低粘度条件下，这些探针表现出非常差的回音信号，源于香豆素与喹啉之间的C–C单键旋转，导致TICT分子通过非辐射转变去激发。另一方面，荧光强度的恢复被归因于高粘度下这些旋转的抑制，从而增强了荧光。此外，在整个 2.5 cP 到 1150 cP 的范围内，发现 QI-1 的荧光强度与粘度之间存在良好的线性关系，线性方程可定量表示为：log I = 0.39437*log η+ 1.56777 （R2 = 0.99555），这意味着QI-1可能作为高灵敏度荧光探针，用于溶液粘度的量子检测。同样，QI-2和QI-3也观察到粘度响应性质，η及其线性方程也可确定为：QI-2：log I = 0.44736*log η +1.65087（R2 = 0.91235），QI-3： log I = 0.44822*log η + 1.46838 (R2 = 0.95770）。然而，由于相关系数较低，QI-2和QI-3的线性性较差。因此，QI-1在定量检测溶胶粘度方面表现优于另外两款探针。与此同时，测量了QI-1在不同粘度溶液中的荧光寿命。随着粘度的增加，QI-1的荧光寿命逐渐从0.52 ns增加到1.07 ns，这与其荧光强度一致。因此，QI-1被用于后续研究。
细胞生物成像
在不同浓度下暴露12小时后，细胞活力保持不变，显示出极低的细胞毒性。延长孵育时间（24小时）后，除最高测试剂量（50 μM）外，所有浓度的细胞存活率仍保持在80%以上，表明其浓度依赖性效应仍处于可接受的生物相容性范围内。这些综合结果确立了QI-1在生物应用中的优异生物相容性特征。通过在HepRG细胞中的分析（表征了探针的性能稳定性。值得注意的是，QI-1在长时间照射下表现出卓越的光稳定性，在连续激光激发的9分钟成像过程中荧光强度保持稳定。这种极低的光漂白现象表明其适合用于长时间的时间推移荧光成像应用，对于长期的细胞研究具有关键优势。使用激光共聚焦显微镜观察细胞对QI-1的摄取情况，以确定探针与细胞在后续实验中的最佳孵育时间。随着探针孵育时间的增加，细胞内探针的荧光强度逐渐增强。2小时的荧光强度明显高于其他时间点，表明探针在此时在细胞中积累更多。因此，随后选择2小时作为最佳孵育时间。为了表征 QI-1 的细胞器特异性靶向特性，进行了荧光共定位研究。定量共定位分析显示其具有特异的线粒体定位（皮尔逊相关系数 (PCC) = 0.84），与溶酶体的关联极少（PCC = 0.12）。统计学显著的线粒体靶向性确认了探针对线粒体微环境的特异性。细胞在饥饿条件下通过诱导自噬来增加线粒体粘度，乙酰氨基酚 (APAP) 也会通过增强自噬改变线粒体粘度，从而损伤细胞。与对照组相比，饥饿组的荧光信号显著增加，表明通过在饥饿条件下启动自噬线粒体粘度增加，而在加入自噬抑制剂 3-MA 后荧光信号下降。在饥饿条件下并加入 APAP 后，荧光信号进一步增强，表明 APAP 的加入导致自噬增强，而在加入 3-MA 后信号仍然下降。以上结果表明，QI-1 可用于自噬诱导的细胞内线粒体粘度成像。
小鼠粘度生物成像
我们首先在尾静脉注射后检查了QI-1的组织分布，结果显示该探针主要分布在肝脏和肾脏，可用于肝肾相关疾病中黏度变化的研究。为了进一步验证QI-1在体内的应用性，我们构建了APAP诱导的肝损伤模型。APAP可通过诱导自噬引起肝细胞损伤和线粒体黏度变化。APAP组在尾静脉注射后荧光信号随时间增加，并在2小时达到峰值，而3-MA处理组的荧光信号强度维持在与对照组相似的水平。与体内成像数据一致，丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平以及肝组织的H&E染色确认了肝细胞损伤，进一步支持了QI-1在活体动物中进行黏度成像的可靠性。
结论
我们成功开发了三种基于香豆素-喹啉的近红外探针，具有可调控的光物理性质。电子丰富的香豆素给体与电子缺乏的喹啉受体的有效结合促进了增强的分子内电荷转移（ICT）效应，而三苯胺单元的引入则改善了聚集诱导发光（AIE）行为及对粘度的感应性能。在所合成的化合物中，QI-1 展现出优异的 AIE 特性、高光稳定性及对粘度的高敏感性。其靶向线粒体并监测细胞自噬及对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤中粘度变化的能力，凸显了其在生物医学领域的应用价值。
参考文献
Synthesis and characterization of coumarin-quinoline based NIR probes for viscosity: Mitochondria-Targeted probe with superior performance in autophagy and liver injury imaging，Lei Sun, Wenze Zhang，Chaoran Li, Jiangwei Tian, Jiwei Li, Haijun Xu，Anal. Chim. Acta.，1380 (2025) 344782，https://doi.org/10.1016/j.aca.2025.344782.
