内容提要
我们设计了一种新的具有肿瘤靶向能力的近红外可激活光敏剂（NIR-NBB），其由近红外光敏剂NPA-NH 2和过氧亚硝酸盐（一种关键的肿瘤指示剂）的酮酰胺识别位点组成。该试剂可高灵敏度地检测ONOO-，并在肿瘤细胞的线粒体中特异性积累，在660 nm激光照射下，可促进细胞内高水平的细胞毒性ROS的积累，引发广泛的线粒体自噬，从而增强脂质过氧化和内源性铁凋亡，从而达到最佳的抗肿瘤效果。
结果和讨论
NIR-NBB的合成及其光化学性质
在生理条件下评价NBB，37 ℃，乙醇，在加入ONOO后，NIR-NBB显示出其最大吸收的红移，从640 nm移动到700 nm。同时，溶液颜色明显地从蓝色变为黄色，这是肉眼可见的变化。随后，通过滴定实验研究了NIR-NBB对ONOO的传感性能，结果表明：NIR-NBB在730 nm处的荧光强度随ONOO-浓度的增加而增加，显示了大约10倍的信号增强，可能是由于NPA-NH 2产物的形成。检测限低至0.025 μM（3σ/k），表明该方法具有高度灵敏度。ONOO的NIR-NBB检测。为了评估NIR-NBB对ONOO的动态响应，在加入不同浓度的ONOO后，随时间跟踪荧光强度变化，NIR-NBB在730 nm处的荧光强度表现出ONOO的浓度依赖性增加，在30 min内稳定，表明NIR-NBB对ONOO具有良好的动力学响应。为了进一步研究NIR-NBB的选择性，为了评估NIR-NBB对ONOO的动态响应，在加入不同浓度的ONOO后，随时间跟踪荧光强度变化，NIR-NBB在730 nm处的荧光强度表现出ONOO的浓度依赖性增加，在30 min内稳定，表明NIR-NBB对ONOO具有良好的动力学响应。
为了评估NIR-NBB的光敏性，将其通过ONOO荧光素活化，然后使用1，3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）（一种单线态氧（1O2指示剂）进行测试。DPBF是专门设计用于捕获1O2的荧光探针，导致其在415 nm处的特征吸收峰降低。DPBF急剧下降在功率密度为1.2 W/cm 2的660 nm激光照射下，NPA-NH 2溶液在415 nm处的吸光度在2 min内下降了91.43%，NPA-NH 2溶液是ONOO活化NIR-NBB的产物。NIR-NBB具有较强的产生单线态氧的能力，但在相同激发功率密度下，经ONOO活化后的NIR-NBB在660 nm激光照射下的光敏性较差（1.2 W/cm2），可能归因于NIR-NBB从激发单重态到激发三重态的系间跃迁过程减弱。此外，光稳定性，在相同的曝光条件下，在ONOO-活化之前和之后对NIR-NBB进行了评价。（活化前）和NPA-NH 2（活化后）与市售试剂Mito-Tracker Deep Red相比显示出上级光稳定性。NPA-NH 2保持稳定的荧光强度，而Mito-Tracker Deep Red的荧光强度降低了81.69%。
可视化ONOO-活细胞
为了诱导内源性ONOO-产生，用LPS和IFN-γ处理HepG 2细胞12小时，然后用共聚焦激光显微镜（CLSM）成像。与仅用NIR-NBB孵育的细胞相比，用LPS和IFN-γ处理的细胞显示出显著更强的红色荧光信号（对照组），表明ONOO-水平升高相反，在LPS和IFN-γ处理的HepG 2细胞中，在用氨基胍（AG）或2，2，6，6-四甲基哌啶氧基（克里思）。这种减少归因于AG抑制一氧化氮合酶和克里思清除超氧化物活性导致的ONOO-水平降低。这些发现证明了NIR-NBB对内源性ONOO的强烈和特异性反应，强调了其在高级生物成像应用中的潜力。此外，该实验进一步揭示，4 T1细胞中的相对荧光强度比在四种正常细胞（3 T3-L1、MCF-10A、HK-2、H9 C2）中观察到的高约3倍，NIR-NBB，表明4 T1癌细胞中内源性ONOO浓度升高。为了检查NIR-NBB的细胞内分布，使用MitoTracker绿色和Lyso-Tracker绿色进行共定位实验。ONOO-激活后，NIR-NBB的红色荧光与Mito-Tracker绿色荧光强烈重叠这些发现表明，NIR-NBB主要在线粒体中积累，有助于有效监测线粒体内的ONOO-水平。此外，NIR-NBB在光照射时产生的ROS直接相互作用，导致线粒体损伤，增强对癌细胞的细胞毒性作用。
NIR-NBB的体外抗肿瘤活性
鉴于NIR-NBB的上级体外成像特性及其作为光敏剂的潜力，在活细胞中进一步探索其抗肿瘤作用。（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）测定。即使在15 μM的高浓度下，在无光条件下孵育12小时后，NIR-NBB没有显著降低4 T1细胞的存活率，表明NIR-NBB对细胞的副作用最小，体外生物相容性良好。在相同的实验条件下，用660 nm激光照射，NIR-NBB孵育的4 T1细胞显示出显著的细胞毒性。即使在2 µM的低浓度下，4 T1细胞的存活率也仅为13.27%，这表明NIR-NBB在光暴露后被ONOO-激活后具有显著的光动力学效力。此外，为了直观地证实NIRNBB的光动力学效应，a钙黄绿素-乙酰氧基甲酯/碘化丙啶进行（钙黄绿素-AM/PI）染色实验以区分有或无660 nm激光照射的活细胞和死细胞。活细胞被钙黄绿素-AM染成绿色，而死细胞被PI染成红色。在NIR-NBB +激光组中观察到大量红色荧光，而对照组和仅NIRNBB组显示出强的绿色荧光，表明对照组和仅NIR-NBB组均未诱导细胞死亡，而在660 nm激光照射下的NIR-NBB诱导肿瘤细胞死亡。视觉上证明NIR-NBB结合660 nm激光照射有效杀死4 T1细胞。这证实了NIR-NBB的强光毒性。
NIR-NBB的体内抗肿瘤活性
在评价NIR-NBB的体内治疗效果之前，首先使用溶血试验评估了NIR-NBB的血液相容性，紫外吸收光谱表明，在含有红细胞的PBS中，所有测试浓度的NIR-NBB的溶血率均不超过1.9%，其显著低于材料溶血性能评估标准规程规定的临界安全溶血阈值5%（ASTM F756-17）此外，在4 T1皮下移植的荷瘤小鼠中进行荧光体内成像实验，并且显示肿瘤部位处的荧光强度在2小时饱和。这些结果证实了NIR-NBB适用于随后的体内实验。使用Balb/c中的4 T1细胞建立小鼠皮下乳腺癌模型。
将小鼠分成四个治疗组以评估治疗结果：（G1）对照组、（G2）NIR-NBB组、（G3）激光组和（G4）NIR-NBB脉冲激光组。然后肿瘤内注射NIR-NBB或PBS。2小时后，光处理组中的小鼠在肿瘤部位暴露于660 nm激光照射15分钟，而对照组不接受光处理。然后监测小鼠12天，在此期间仔细监测体重和肿瘤体积的变化。对照组中的肿瘤表现出侵袭性生长，达到554.4mm3的平均体积，其远大于初始肿瘤的体积。相比之下，NIR-NBB +激光组显示平均体积减少约15倍。在整个治疗过程中，所有组中均未发生显著的体重变化此外，较低的切除后肿瘤重量和肿瘤照片都证实了在660 nm激光照射下NIR-NBB治疗的抗肿瘤效果。这些发现证明了NIR-NBB抑制肿瘤的能力。NIRNBB对各脏器均无明显影响，说明NIRNBB具有可靠的生物安全性然而，来自四组小鼠的肿瘤组织的H & E染色显示，对照组具有紧密聚集的细胞核和保留的细胞结构。NIR-NBB+激光组显示出大的坏死区域，突出了当被激光激活时NIR-NBB的显著抗肿瘤活性。免疫组化结果显示，NIR-NBB能显著上调自噬标志物LC 3 II，下调铁凋亡标志物GPX 4，从而进一步阐明NIR-NBB抗肿瘤的机制，在NIR-NBB +激光组中，表明肿瘤的治疗机制由线粒体自噬和铁凋亡介导。
总结
我们开发了一种ONOO激活的治疗诊断剂NIR-NBB，用于通过线粒体自噬和铁细胞凋亡介导的三阴性乳腺癌治疗。NIR-NBB对ONOO具有很强的敏感性和选择性，不仅能发出高信噪比的强荧光信号用于选择性肿瘤细胞成像，而且能特异性地靶向肿瘤细胞的线粒体。在660 nm激光照射下，活化的NIR-NBB在线粒体内产生大量的活性氧，诱导线粒体自噬，进而引发铁细胞凋亡，体外和体内实验均表明NIR-NBB具有很强的抗肿瘤作用。
参考文献
Enhancing mitochondria-targeted photodynamic therapy via synergistic mitophagy-ferroptosis by a peroxynitrite-activated near-infrared photosensitizer in triple-negative breast cancer，Jia Huang , Yuanyuan Wang , Wanting Zhang , Wei Zeng , Jiaoli Zhang , Dan Cheng , Longwei He *, Jia Zhou **，Sens.Actuators .B 446 (2026) 138728，https://doi.org/10.1016/j.snb.2025.138728
