内容提要
创建通用平台来开发双通道近红外荧光(NIRF)和光声(PA)探针，特别是那些设计最小化通道串扰的探针，对于精确的生物标志物检测至关重要。为了弥补这一差距，本研究引入了一个创新的基于花青素的平台CySN。CySN平台表现出显著的移波长特性，包括衰减反应后较大的荧光模态移位(68 nm)和PA模态移位(145 nm)。这些实质性的变化导致了异常高的比率NIRF变化603倍，比率PA变化261倍。利用CySN平台，已成功开发出用于检测小分子生物标志物(H2O2)和酶生物标志物(酯酶)的双通道NIRF/PA探针。这些探针在体外具有高灵敏度和选择性，能够通过双通道NIRF/PA检测检测其目标。探针有效地利用NIRF信号对活细胞中的目标分析物进行成像。该探针能够通过检测肿瘤标志物(H2O2和酯酶)来准确诊断肿瘤，比正常组织显示出3.6至7倍的比例增强。因此，CySN平台具有进一步推进双通道NIRF/PA探针在疾病诊断中的生物分子检测的发展潜力。
结果与讨论
双通道NIRF/PA平台设计与模型实验
我们假设基于花青素的IR-780模拟物非常适合构建目标平台，因为:1)它的长波长有利于体内成像;2)不同给体(S, N, O)可修饰菁染料的吸收、荧光和PA信号;3)染料的NIRF和PA信号能量转换分布均衡;4)基于花青素的荧光团具有很高的临床转化潜力。另一方面，生理条件下(pH = 7.4)， C─S键的热力学稳定性低于C─N键。在菁染料中，NH基团倾向于攻击附近C─S键中的S原子。这一过程最终导致形成更稳定的C─N键。因此，我们开发了CySN平台，这是一种硫取代的菁氨酸与半胱胺连接体相结合的平台，它被一个识别基团所包围。当目标触发衰减反应时，CySN经历1,6消除，随后是Smiles重排。因此，探针的NIRF和PA信号都经历了显著的蓝移，提供了一个独特的比率读数。
为了评估CySN平台对双通道NIRF/PA响应的适用性，我们初步合成了CySN- boc并进行了模型实验。CySN-Boc的Boc基团可以通过TFA去除，形成中间体CySN-NH3 +。在酸性缓冲液(pH = 2)中，质子化的NH基团不取代S基团，并表现出其初始信号。在中性缓冲液(pH = 7.4)中，NH基团会攻击S基团，导致Cy-NS的产生。这种转变会导致CySN-NH3 +的吸收和发射发生明显的蓝移。
用TFA脱保护后，CySN-NH3 +本身在812 nm处出现了一个高发射峰。正如预期的那样，在中性环境下，CySN-NH3 +在812 nm处的荧光发射峰明显下降，同时由于供体从S到n的交换，在744 nm处出现了一个新的荧光发射峰。此外，CySN-NH3 +从酸性环境过渡到中性环境后，其吸收信号和PA信号分别从780 nm移动到635 nm。此外，我们评估了CySN-Boc和Cy-NS的光物理性质。结果表明，CySN- boc和Cy-NS具有较高的消光系数(>104 M−1 cm−1)和合适的量子产率，支持CySN具有平衡的荧光和PA输出以及双通道NIRF/PA响应能力。
接下来，我们利用模型实验对CySN平台的双通道NIRF/PA特性进行了更深入的定量分析。CySN平台从CySN- boc过渡到CyNS后，在荧光模态上发生了68 nm的波长偏移，在PA模态上发生了145 nm的波长偏移。CySN平台在荧光/PA模式下的波长位移比先前报道的AS-Cy平台高1.7/2.4倍，表明CySN平台的通道覆盖减少，特别是PA通道。因此，CySN平台显示NIRF比率(F744/F812)变化603倍，PA比率(PA635/ PA780)变化261倍。与AS-Cy相比，CySN平台的比值变化增强了1 ~ 2个数量级，表明CySN平台的检测灵敏度显著提高。我们还采用理论计算来研究AS-Cy和CySN平台的光物理性质。选择as - cy - oac / as - cy - o -和CySN-Boc/CyNS结构作为笼型/亲本荧光团进行对比研究。观察到CySN对表现出更强的conjugation，电子云分布在整个分子骨架中，HOMO-LUMO能隙比AS-Cy对更小，表明CySN对的波长更长。CySN对的计算吸收/荧光光谱也比AS-Cy对长，说明CySN平台更适合于深部组织成像。CySN对的理论去激发能(激发态)差值为0.10 eV，大于AS-Cy对的0.04 eV，为减小CySN的通道串扰提供了理论基础。此外，由于N和S的给电子能力不相等，我们观察到CySN对中N原子的电子从HOMO向LUMO的转移比S原子更显著。CySN对中给电子基团的电子转移的巨大差异可能是导致串扰比AS-Cy对小的原因。
双比率探针CySN-H和CySN-E的光学性质
受模型实验结果的激励，我们继续研究CySN作为构建可激活探针的通用平台的多功能性。我们合成了过氧化氢CySN-H探针和酯酶CySN-E探针，分别代表小分子和酶生物标志物的检测。这些化合物的详细合成过程和核磁共振表征在辅助信息中提供。有了这些探针，我们首先研究了它们的吸收特性在有和没有生物标志物的情况下的变化。随着H2O2 (0 ~ 100 μM)和酯酶(0 ~ 100 U L−1)浓度的增加，两种探针在780 nm处的吸收峰逐渐减小，而635 nm处的新吸收峰不断增加。这些结果与模型反应一致，证明了衰缩反应、1,6消除和Smiles重排的成功发生。进一步的HPLC和MS分析表明，探针与相应的分析物孵育后形成所需的产物(辅助信息)。在高效液相色谱分析中发现了一些副产物，这些副产物可能是醌的甲基化或其与CyNS的Michael加成产物。然而，在细胞环境中添加巯基化合物(如谷胱甘肽)可能会抑制这些副产物。此外，使用替代连接而不是自焚连接可以改善这一限制。
接下来，我们利用双荧光通道研究了探针的荧光特性变化。时间依赖性实验表明，CySN-H在约3小时(200 μM H2O2)达到平台，CySN-E在约1小时(100 U L−1酯酶)达到平台(Ex = 635 nm, Em = 744 nm)。此外，随着生物分析物浓度的增加，812 nm处的发射峰急剧下降，而744 nm处的荧光强度逐渐增加。两种探针的荧光强度比F744/F812与浓度范围呈良好的线性关系(H2O2: 0 ~ 20 μM;酯酶:0-40 U L−1)，证明了CySN平台对不同生物分析物的比例传感能力。CySN-H的比例荧光检测限为189 nM, CySN-E的比例荧光检测限为0.31 U L−1。
我们使用双声压通道进一步研究了探针的声压响应。根据吸收光谱，两种探针与H2O2 (0-80 μM)和酶(0-120 U L−1)反应后，PA信号也发生了从780 nm到635 nm的蓝移。比例分析法的检出限(LOD)测定为:CySN-H为3.7 μM, CySN-E为6.8 μ L−1。这些结果有力地证明了CySN-H和CySN-E可以通过双通道NIRF/PA模式高效、灵敏地检测其靶标。
接下来，我们评估了CySN-H和CySN-E对其他生物干扰试剂的选择性。这两种探针在Abs635/Abs780、F744/F812和PA635/PA780中对H2O2、酯酶的表达均有显著增强。相比之下，当暴露于其他干扰化合物，包括金属离子、活性氧、生物硫醇和其他酶时，观察到最小的信号变化。值得注意的是，CySN-H和CySN-E在与各自的靶标相互作用后，F744/F812比值分别增加了395倍和367倍。此外，两种探针的PA635/PA780比值增加了50倍以上。这些比值信号的变化明显高于其他NIRF/PA探针。这些结果共同表明，通过双比NIRF/PA检测，CySN-H和CySN-E对其靶标表现出出色的选择性。总之，CySN展示了其作为设计高性能双通道NIRF/PA探针的多功能平台的潜力，适用于小分子和酶分析。
活细胞中CySN-H和CySN-E的NIRF成像
我们继续评估CySNH和CySN-E的细胞成像能力。我们首先使用CySN-H检测HeLa细胞中外源性和内源性H2O2。对于外源H2O2组，细胞用CySN-H孵育，然后再用H2O2处理30分钟。内源性H2O2组分别与CySN-H单独孵育30分钟，或与phorbol 12-肉豆酸酯13-乙酸酯(PMA)共孵育30分钟，PMA刺激细胞分泌H2O2。CySN-H通过NIRF通道有效检测HeLa细胞中外源性和内源性H2O2。添加PMA诱导NIRF通道增强2.5倍，与外源H2O2观察到的效果相当。
随后，我们研究了CySNE在活细胞中的传感能力。HeLa细胞用CySN-E孵育，有或没有酯酶抑制剂4-(2氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)预处理。体外实验首次证实了AEBSF抑制酯酶活性的有效性。细胞成像实验显示，未经处理的细胞的红色荧光明显高于抑制剂孵育的细胞，表明CySN-E有效检测活细胞中的酯酶活性。此外，我们进行了紫外线辐射研究，因为它可以导致细胞死亡并导致酯酶失活。具体地说，Hela细胞在有或没有紫外线的情况下处理40分钟，然后用CySN-E孵育30分钟。与未处理的细胞相比，暴露于紫外线下的细胞表现出明显较低的红色荧光。研究结果表明，CySN-E是一种通过检测酯酶活性来监测细胞健康的可行方法。
以CySN-H为例，我们进一步评估了探针的比率荧光成像能力。收集HeLa细胞微球，采用与共聚焦成像实验相同的处理方法，使用体内成像系统进行成像。在未处理的HeLa细胞中，观察到通道2 (Ex 740 nm, filter 790 nm)的荧光发射明显高。加入H2O2或PMA后，通道2的荧光强度显著降低，通道1的荧光强度显著增加(Ex. 640 nm, filter . 710 nm)。此外，计算出的H2O2/PMA处理HeLa细胞的荧光比(F1/F2)明显高于未处理HeLa细胞。这些发现有力地证明了我们的探针在活细胞中的NIRF比率成像能力。
小鼠肿瘤模型中CySN-H和CySN-E的比例PA成像
我们进一步研究了基于CySN的探针在体内比例成像中的潜在应用。异种移植4T1肿瘤模型按照上述方案建立。已知肿瘤微环境中H2O2浓度较高。通过将CySNH皮下注射到小鼠的肿瘤和健康肢体中，初步评估了CySNH的性能。在肿瘤组中，从0到60分钟，PA780信号明显减弱，而PA635处的信号强度逐渐增强。相比之下，对照组的PA780和PA635通道均无明显变化。肿瘤中PA635/PA780比值明显升高，2小时后达到平稳期。比值信号比正常肢体高7倍。
酯酶在癌细胞内过表达，在肿瘤的生长、侵袭和迁移中起着至关重要的作用。我们进一步评估了CySN-E在异种移植4T1肿瘤模型中的表现。同样，在小鼠肿瘤和健康肢体皮下注射CySN-E。肿瘤组在780 nm处PA信号逐渐下降，同时PA635的强度增加。相反，正常肢体的两个PA通道在2小时内变化不大。肿瘤组内PA635/PA780比值在2小时内升高至1.3，肿瘤组中PA635/PA780比值是健康小鼠肢体的3.6倍。值得注意的是，比值法PA信号的肿瘤与正常组织的比值远高于基于AS-Cy的探针。此外，当CySN探针在肿瘤内的反应达到饱和时，两个通道(PA635/PA780)的比例保持相对稳定，而ICG(一种“永远打开”的试剂，在780 nm处只有一个PA通道)的PA信号在注射到肿瘤后随着时间的推移而下降。这表明CySN作为比值平台，可能比ICG染料更适合长期肿瘤PA成像。两种探针的优异性能表明，CySN- h和CySN- e在肿瘤诊断方面具有巨大的潜力，使CySN成为体内比例成像的优秀平台。
总之，我们已经建立了一个通用平台CySN，用于设计具有最小通道串扰和超大双比率信本比的双通道NIRF/PA探头。模型实验表明，CySN在F744/F812中实现了603倍的显著变化，在PA635/PA780中实现了261倍的显著变化，与之前报道的NIRF/PA探针相比，这是一个显著的增强。在CySN的基础上，我们设计了CySN- h和CySN- e探针，分别用于过氧化氢和酯酶的双通道NIRF/PA检测。两种探针在体外实验中均表现出较高的灵敏度和选择性。CySN利用两种比例信号中通道覆盖最小的优势，在活体小鼠的PA成像中表现优异，有利于肿瘤模型中H2O2和酯酶活性的检测。在体内检测的比例倍率PA增强折叠高，显着提高了探针的效率和准确性。我们预计CySN平台将促进更强大的双通道NIRF/PA探针的开发，用于检测疾病诊断中的其他关键生物分析物。此外，我们设想我们的设计将激发进一步优化光学探针的努力，以提高临床应用中的性能。
参考文献
A General Cyanine-Based Platform for Designing Robust Dual-Channel Near-Infrared Fluorescent and Photoacoustic Probes， Pingzhou Wu, Zheng Qu, Jie Zhang,* Xiaojie Ren, Dongqing Wang, Chen Huang, Ke Cheng, Junyang Qi, Heng Shi, Shenglong Gan, Wenyu Wei, Yachao Zhang, Chun-Sing Lee, Lidai Wang,* and Hongyan Sun*，Adv. Funct. Mater. 2024, 2400597,https://doi.org/10.1002/adfm.202400597
