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内容提要

   9′-氧杂蒽]官能化的苯并双噻二唑类NIR-II染料（命名为BSFX-BBT和OSFX-BBT）由于给体和受体单元之间的弱排斥作用和S…N二级相互作用，使染料在合成时采用了一种新的结构，共面分子构象，并在溶液中显示>880 nm的峰值吸收。重要的是，BSFX-BBT能在凝聚态形成理想的J-聚集体，飞秒瞬态吸收光谱表明J-聚集体的激发态是辐射态，J-聚集体能促进受激发射，因此，J-聚集体纳米粒子（NPs）在1124 nm处显示出高的相对量子产额（0.81%），有效的近红外-Ⅱ发射，良好的光热效应和生物相容性使得J-聚集的NPs通过荧光/光声成像引导的光疗显示出有效的抗肿瘤功效。该范例表明，通过螺官能化策略调节NIR-II染料的聚集状态是增强光治疗诊断性能的有效途径。

实验结果与讨论

SFX功能化BBT的合成与表征

   螺旋[芴-9,9 ' -杂蒽](SFX)具有垂直构型，具有较大的位阻，可以阻碍分子间的面对面stacking。此外，烷基链的长度对聚集体的行为也起着重要的调节作用。为了减少供体与BBT核之间的排斥相互作用，将一个五元环噻吩融合到SFX单元中。首先，与2-溴噻吩-3-羧酸甲酯偶联(螺[芴-9,9 ' -黄原糖]- 2-基)-硼酸蒎醇酯，得到sfx功能化的中间体1。然后，中间体通过芳基锂的亲核反应和分子内Friedel-Crafts循环反应转化为平面构型给体单元2。最后，在pd催化的偶联反应下，硼化供体与4,7-二溴并苯双噻二唑偶联得到BSFX-BBT和OSFX-BBT，产率分别为13%和14.2%。中间体和目标化合物的化学结构通过核磁共振、质谱和红外光谱进行了表征。为了了解染料的分子和电子结构，在B3LYP/6-31g(d, p)的水平上通过密度泛函理论进行了理论计算。正如预期的那样，sx功能化的BBT衍生物在基态呈完全平面构象，二面角为0.7°，这可能是由于供体和受体之间的弱排斥以及S…N的二级相互作用(S…N的距离为2.806 Å)。平面结构可以延长有效conJugation长度，延长吸收/发射谱线。此外，丁基苯基和黄烷位于conJugation大平面的两侧，可以抑制聚集态的面对面堆积。最高已占据分子轨道(HOMO)沿整个conJugated骨架离域，而最低未占据分子轨道(LUMO)主要定位于电子接受体BBT核心，说明供体-受体结构促进了HOMO和LUMO的分离，从而导致能隙减小。结果表明，BSFX-BBT和OSFX-BBT的HOMO和LUMO值分别为- 4.61和- 3.42 eV，因此计算出的能隙为1.19 eV，说明衍生物具有近红外吸收和NIR-II发射能力。

光物理性质

   在二氯甲烷(DCM)溶液中，BSFX-BBT的最大吸收/发射波长和摩尔消光系数为882/1078 nm和2.88 × 104 L cm⁻¹ mol⁻¹,OSFX-BBT的最大吸收/发射波长为901/1082 nm和1.69 × 10⁴ L cm⁻¹ mol⁻¹,FT-BBT的最大吸收/发射波长为835/1045 nm和2.24 × 10⁴ L cm⁻¹ mol⁻¹。与FT-BBT相比，BSFX-BBT和OSFX-BBT的谱移较大可归因于分子构象平面化，从而延长了有效共轭长度。BSFX-BBT在甲苯中的相对QY为16.3%，OSFX-BBT在甲苯中的相对QY为13.3% (FT-BBT作为参考NIR-II染料，QY为19%)，表明减小能差导致QY略有下降。在980 nm激光激发下，BSFX-BBT粉末表现出较强的NIR-II荧光，而OSFX-BBT和FT-BBT粉末的荧光强度很低。出乎意料的是，通过再沉淀法制备的BSFX-BBT NPs(命名为Beta NPs)和OSFX-BBT NPs的荧光非常弱，因此我们尝试将BSFX-BBT粉末直接声纳成NPs(命名为Alpha NPs)。α、β和OSFX-BBT NPs的最大吸收波长为901、886和943 nm，最大吸收波长为1.84 × 104、1.78 × 10⁴和1.61 × 10⁴ L cm⁻¹ mol⁻¹。有趣的是，α - NPs在≈1062 nm处出现了一个新的肩吸收峰，波长为6.8 × 10³L cm⁻¹ mol⁻¹。虽然BSFX-BBT和OSFXBBT具有相同的共轭主链，但吸收光谱的显著差异主要是由于它们的聚集行为不同，而这种聚集行为受烷基链长度的影响。为了更好地了解BSFX-BBT的聚集行为，我们监测了不同THF体积分数(fw)的THF/水混合物中BSFX-BBT的吸收变化。当fw从100%降低到10%时，BSFX-BBT的吸收峰从878 nm红移至950 nm，说明BSFX-BBT在不良溶剂中形成有序聚集体。此外，我们还测量了α、β和OSFX-BBT NPs的拉曼光谱。1426和1600 cm⁻¹的波段在所有NPs中保持不变，可以归因于共轭主链的C = C拉伸，而1259、1355和1403 cm⁻¹的波段在Alpha NPs中显示出6-9 cm⁻¹的下降。在具有超分子J聚集体的苝酰亚胺和花青素衍生物中也观察到类似的现象。因此，光物理性质和拉曼数据的集合结果表明，BSFX-BBT可以在Alpha NPs中自组织成J-aggregate。由于螺旋循环结构和丁基苯基的较大位阻效应，有效阻碍了分子间面对面π-stacking，因此BSFX-BBT在结晶状态下可能采用首尾滑移叠加模式(J聚集体)。烷基链的弱范德华力可以稳定J聚集结构。由于在OSFX-BBT中没有观察到带有八氧基的J -聚酰基，说明长烷基链阻碍了J -聚酰基的形成，且烷基链长度起着重要的作用。据我们所知，BSFXBBT是第一个基于J -骨料的bbt基染料的例子。此外，由于BSFX-BBT和OSFX-BBT的超分子相互作用弱，空间位阻大，在快速再沉淀过程中难以有效自组装成有序结构，OSFX-BBT和Beta NPs均为无定形态。

Beta NPs的峰值发射红移从1098 nm到1124 nm，相对QY从Beta NPs的0.07%提高到Alpha NPs的0.81%，而osfi - bbt NPs的峰值发射在1115 nm，相对QY为0.08%。，Alpha NPs的QY在NIR-II染料中是最高的，其峰值吸收大于800 nm。此外，FT-BBT NPs的QY约为0.02% [1c]，与OSFX-BBT和Beta NPs相比，FT-BBT的QY提高了约4倍，表明大的空间位阻效应可以部分抑制ACQ效应。在相同浓度(100 μg mL⁻¹)和实验条件下，FT-BBT、OSFX-BBT、Beta和Alpha NPs的NIR-II荧光强度分别为604、3172、3174和51 440。OSFX-BBT和Beta NPs具有相似的荧光强度，与FT-BBT NPs相比，Alpha和Beta NPs的荧光增强约为5倍和85倍。与Beta NPs相比，加入Jaggregate的Alpha NPs可显著增强荧光强度约16倍，说明J-aggregate可有效对抗聚集态荧光猝灭，提高NIR-II荧光效率。更重要的是，以往的研究表明，共面构象的BBT衍生物由于严重的ACQ效应，其聚合态的QYs较低。然而，这项工作可以彻底改变我们对共面BBT衍生物的看法，并为高性能长吸收波长NIR-II染料的分子设计提供新的原理。

光热性能研究

   为了深入了解聚集体态对光热性质的影响，研究了α和β NPs在808 nm激光照射(P = 0.5 W cm⁻²)下的光热效应。α和β NPs水溶液(100 μg mL⁻¹)的温差(ΔT)在10 min内迅速增大到15.7、16.8和17.5℃，而去离子水(DI水)的温差(ΔT)仅升高约2.6℃，表明α、β和OSFX-BBT NPs光热效果良好。计算出Alpha、Beta和OSFX-BBT NPs的光热转换效率(PCE)分别为36.7%、37.1%和32.7%。实验结果表明，sfx功能化BBT衍生物的聚集态对光热性能影响不大。正如预期的那样，在808 nm激光照射下，α和β NPs都表现出良好的功率影响和浓度依赖的温度升高。此外，α和β NPs的光热效应在5个加热-冷却循环中没有明显变化，符合α和β NPs良好的光热稳定性。

体外对癌细胞的杀伤效果

   首先，通过动态光散射和透射电镜对α和β NPs的大小和形态进行了测量。Alpha NPs呈不规则结构，而Beta NPs呈球形形态。α和β NPs均能形成清晰的溶液，表现出良好的水分散性，α和β NPs的水动力学尺寸分别为202.3±130.8 nm和115.4±56.1 nm，表明NPs在肿瘤部位容易通过被动靶向能力加速。Alpha NPs的Zeta电位为- 16.96 mV, Beta NPs的Zeta电位为- 23.21 mV，因此NPs可以形成稳定的胶体溶液。α - NPs在室温下保存两周后，在去离子水和PBS溶液中，其荧光强度和大小基本保持不变，表明α - NPs在生理环境中也具有良好的稳定性。

   其次，基于α - NPs良好的体外光热性能，采用标准的3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2- h -溴化四唑(MTT)法评价α - NPs对4T1细胞的杀伤效果和生物相容性。在没有激光照射的情况下，当培养浓度增加到120 μg mL⁻¹时，4T1细胞的存活率仍保持在0.8以上，表明Alpha NPs具有良好的生物相容性。在808 nm激光照射下(P = 0.5 W cm⁻²)，α - NPs具有浓度依赖性的杀伤作用，但细胞活力随着培养浓度的增加而逐渐降低，IC50值约为68 μg mL⁻¹。为了直接观察α NPs对4T1细胞的杀伤作用，我们进行了活细胞/死细胞染色实验。在有/没有激光照射的对照组和没有激光照射的Alpha NPs中，4T1细胞保持了较高的存活率，而大部分癌细胞在激光照射下被杀死，证实Alpha NPs可以通过激光触发的光热效应有效杀死癌细胞。

体内NIR-II荧光和光声成像

   由于Alpha NPs具有优异的NIR-II荧光效率和良好的生物相容性，我们进一步进行了荧光成像实验。首先，通过将充满nps的毛细血管浸入1%脂质内溶液来评估成像深度。荧光强度迅速衰减，8 mm处的信本比(SBR)约为1.13，说明在980 nm激光激发下，穿透率约为8 mm。其次，首先进行全身血管造影，评估其体内成像性能。经980 nm激光照射(辐照量:35.25 mW cm⁻²;暴露时间:200 ms, LP1100)，后肢血管直径≈0.46 mm，表明NPs是荧光血管造影的良好成像造影剂。第三，为了深入了解Alpha NPs的药代动力学，我们监测了24 h后肢血管荧光信号的变化，荧光信号在注射后约0.5 h达到峰值，然后逐渐下降。由于荧光强度与α - NPs浓度呈正相关，这意味着α - NPs在血液中的药代动力学可能具有零级动力学。注射24 h后仍能观察到荧光，说明α - NPs的血液循环时间很长。最后，在980 nm激光激发下，尾静脉注射Alpha NPs后，在不同时间点获得4T1荷瘤裸鼠体内NIR-II荧光成像。注射后10 ~ 10 h，肿瘤部位荧光强度快速升高，10 ~ 24 h呈平稳状态。令人印象深刻的是，从0到12 h, SBR从1.0快速上升到3.2，在980激光照射下，4T1肿瘤的边缘清晰可见，有助于指导实体瘤手术切除。此外，在注射后24 h，从每只小鼠身上切除主要器官和肿瘤组织，进行离体荧光成像。，NIR-II荧光信号主要分布在脾脏和肝脏，用于清除单核吞噬细胞系统。正如预期的那样，肿瘤也显示出中等的荧光强度，表明Alpha NPs在肿瘤部位具有良好的蓄积作用，增强了通透性和滞留作用。

   进一步进行体内光声成像(PAI)来评估肿瘤中的富集程度，并指导治疗窗口。在注射后0 ~ 8 h，肿瘤部位PA信号快速升高，24 h时达到峰值。以上结果表明，Alpha NPs可以通过被动靶向在肿瘤部位有效积累，并表现出良好的NIR-II FLI和PAI能力，能够检测实体肿瘤的精确三维结构，在多模态成像引导肿瘤光疗中具有很大的应用潜力。

体内肿瘤光疗

   考虑到α - NPs具有良好的体外光热效应和肿瘤靶向能力，我们基于4T1荷瘤Balb/c小鼠模型，采用808 nm激光照射(P = 0.5 W cm⁻²)24 h尾静脉注射α - NPs进行体内光热成像(PTI)实验。PBS对照组肿瘤部位的温度在照射后5min内由33.3℃升高到36.0℃，仅激光照射的热效应可以忽略不计。相比之下，在相同条件下，注射nps的小鼠的温度从31.9℃迅速上升到≈46.2℃，升高的温度足以杀死肿瘤细胞。然后，当肿瘤大小达到约130 mm3时，将4T1荷瘤Balb/c小鼠随机分为三组(PBS组、NPs组和NPs + Laser组)，评估Alpha NPs的光疗性能。在静脉注射PBS (100 μL)或NPs (2 mg mL⁻¹,100 μL)后，PBS和NPs +激光组于注射后24 h用808 nm激光(P = 0.5 W cm⁻²⁾照射肿瘤部位。NPs +激光组在治疗4天后肿瘤生长得到有效抑制，两周治疗期内未见肿瘤复发。而PBS组和NPs组的肿瘤体积在治疗过程中不断增大。此外，所有治疗组的体重在治疗期间均未出现明显变化，表明Alpha NPs具有良好的生物相容性。并于14天后采集三组的主要脏器及肿瘤组织进行组织学分析。苏木精和伊红(H&E)染色肿瘤切片显示，NPs +激光组明显观察到组织破坏和细胞凋亡，显示α - NPs良好的光疗效果。三组大鼠主要脏器均未见明显组织学损伤，说明α - NPs具有良好的生物相容性。上述实验结果表明，在安全剂量的激光照射下，Alpha NPs具有明显的光疗效果。

总结

   我们基于螺旋功能化策略合成了两种具有共面构象的SFX功能化BBT NIR-II染料。与结构扭转FBBT相比，两种染料在溶液中的最大吸收红移均大于45 nm。BSFX-BBT在共面分子构型和螺旋环的空间位阻的协同作用下，可以在凝聚态下自组织成理想的J聚集体。fs-TAS表明，J聚集的NPs具有连续的三个激发态，只有第三个激发态是辐射态，J聚集可以促进受激发射。具有J -聚集的α NPs能够有效抵抗ACQ效应，在1124 nm处显示出较强的NIR-II发射，QY为0.81%，比不规则堆积的NPs高一个数量级。此外，α - NPs具有良好的光热转化能力、生物相容性和突出的肿瘤靶向能力。因此，通过NIR-II FLI/PAI引导的光疗，J聚集的NPs被证明具有有效的抗肿瘤功效。该模式揭示了基于BBT的NIR-II染料可以通过体螺旋功能化策略自组装纳米结构，用于高效的长波激发光治疗剂。

参考文献

J-Aggregate Promoting NIR-II Emission for Fluorescence/Photoacoustic Imaging-Guided Phototherapy， ChangJin Ou, Ziqi Zhao, Lei An, Liangyu Zheng, Fan Gao, Qin Zhu, WenJun Wang, JinJun Shao, Linghai Xie,* and Xiaochen Dong*，Adv. Healthcare Mater. 2024, 2400846，https://doi.org/10.1002/adhm.202400846