内容提要
光声成像(PAI)引导的第二近红外(NIR-II, 1000-1700 nm)窗口光热治疗(PTT)作为一种有前景的癌症治疗平台而备受关注。本文报道Pi-extended卟啉与一个或两个纳米石墨烯单元(NGP-1和NGP-2)融合可以作为一类新NIR响应有机试剂，在NIR-I和NIR-II窗口分别显示出≈1000和≈1400 nm的吸收。NGP-1和NGP-2通过封装成自组装纳米颗粒(NPs)分散在水中，在808 nm和1064 nm激光照射下，光热转换效率分别达到60%和69%。此外，NIR-II活性NGP-2-NPs表现出良好的光声响应，以及高光稳定性和生物相容性，可在体内实现PAI和高效的NIR-II PTT。
实验结果与讨论
纳米粒子的合成与表征
DMP和NGP-1的聚苯乙烯基前体在四氢呋喃(THF)中的吸收位于可见光区，波长最长的吸收峰(λabs.)分别位于515和522 nm处，排除了NIR响应光热对话。与此形成鲜明对比的是，与多环芳烃融合的Pi-extended卟啉，如NGP-1和NGP-2，表现出近红外吸收，为近红外治疗提供了强大的分子工程策略。为了制备可水分散的NPs，通过纳米沉淀法将NGP-1和NGP-2分子与1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n[甲氧基(聚乙二醇)- 2000](DSPE-PEG2000)再沉淀。紫外-可见-近红外吸收光谱显示，NGP-1-NPs和NGP-2-NPs的最长波长吸收峰(λabs)位于873和1159 nm，尾部分别延伸到1000和1400 nm，表明它们在NIR-I和NIR-II窗口中的光捕获能力和光热转换潜力。与λabs相比，NGP1-NPs有9 nm的轻微红移。而NGP-2-NPs在四氢呋喃(THF)中的聚集诱导作用与NGP2基本相同，说明NGP-1在THF中的聚集诱导作用不明显。水中得到的NGP-1-NPs和NGP-2-NPs呈淡黄色或淡蓝色，是透明的分散体，肉眼看不到颗粒，表明这些-extended卟啉在水中分散成功。动态光散射(DLS)分析显示，NGP-1-NPs和NGP2-NPs的平均直径分别为32±3和215±26 nm。与NGP-1-NPs相比，NGP-2- nps的尺寸更大可能是由于NGP-2分子的平面结构扩展，而这些NGP-NPs的TEM图像中的黑点可能归因于垂直于底物的Ni(II)和苯环的高对比度。相同溶液中的NGP-1-NPs和NGP-2-NPs在室温环境条件下储存5天的紫外-可见-近红外吸收光谱变化可以忽略不计，突出了它们在水介质中的良好稳定性。
纳米粒子的光热和光声性质研究
用红外摄像机评估了由此获得的两个NIR -使能光热转换的NGP-NPs。在808 nm或1064 nm (1 W cm-2)激光照射下，这两种不同浓度的NGP-NPs的温度呈浓度依赖性快速升高，红外图像清楚地监测到这一点。辐照10 min后，浓度为30 μg mL−1的NGP-1-NPs和NGP-2-NPs分散体温度分别达到49.3℃和60.6℃。特别是在1064 nm激光触发下，NGP2-NPs的温度显著升高，表明其具有优良的NIR-II光热转换能力。将NGP-2-NPs与常用的NIR-II吸收染料IR1048 (IR1048NPs)的NPs进行比较，评估NPs的光稳定性。虽然使用IR1048NPs达到的最高温度逐渐下降，在5个激光开关周期后从60.2°C降至44.1°C，但NGP-2-NPs在相同条件下表现出不变的光热转换能力，突出了其在水中的优异光稳定性。此外，NGP-1-NPs和NGP-2-NPs在激光照射前后的吸收光谱根据先前报道的方法，计算出NGP-2-NPs的PCE约为69%。NGP-2-NPs的PCE值高于大多数先前报道的NIR-II吸收光热剂，包括有机小分子，超分子自由基，半导体聚合物，和无机材料。NGP-1-NPs也显示出60%的PCE，这是文献中报道的NIR-1吸收剂的最高值之一。在辐照过程中检测到的活性氧可以忽略不计，这可能是由于NGP分子处于低处激发态，阻止了能量向氧分子的有效传递。此外，中心Ni2+离子的重原子效应，也可以解释这些NGP-NPs有利于非辐射弛缓产生热量，这有助于这些NGP-NPs出色的光热转换性能。此外，NIR-II光照射NGP-2-NPs分散体在毛细管中也会产生PA信号，该信号随其浓度成比例增加。相比之下，在相同条件下，NGP-1-NPs色散导致的PA信号可以忽略不计，可能是由于它们在NIR-II区域的光收集能力较弱。NGP-2-NPs具有高PCE，高光稳定性和正光声特性，突出了NIR-II窗口中PAI引导PTT的潜力。
纳米粒子细胞光热性质研究
细胞共定位分析和细胞活力测定评估了NGP-2- nps的细胞内分布和细胞生物相容性，随后使用活细胞/死细胞染色法研究了它们在体外NIR-II激光激活光热消融癌细胞中的性能。由于中心Ni2+离子的重原子效应导致NGP-2的发射被猝灭，我们利用荧光素标记的DSPE-PEG2000制备NGP-2-NPs用于共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)，目的是通过DAPI(细胞核染料)和LysoTracker Red进行细胞共定位分析，揭示它们在细胞内的分布。荧光素标记的NGP-2-NPs的绿色信号位于细胞核外的细胞质中，与LysoTracker红色信号重叠良好，在合并图像中呈现淡黄色信号，表明荧光素标记的NGP-2-NPs在溶酶体中特异性聚集。不含NGP-2分子的荧光素标记的DSPE-PEG2000- nps也在溶酶体中积累，消除了荧光素标记的DSPE-PEG2000对NGP-2- nps细胞内导航调节的潜在影响。由于缺乏针对细胞器的特异性表面功能化，这些NPs可能遵循从早期核内体到晚期核内体和溶酶体的内吞途径。通过标准的3-(4,5二甲基噻唑-2-基)- 2,5二苯基溴化四唑(MTT)试验，对三种细胞系(包括小鼠乳腺癌细胞(4T1)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和正常小鼠成纤维细胞(L929))进行了NGP-2-NPs的潜在细胞毒性评估。与NGP-2-NPs (040 μg mL-1)共孵育24小时后，三种细胞系的细胞毒性均可忽略不计，表现出较高的细胞生物相容性。相比之下，在1064 nm激光(1 W cm-2)照射下，40 μg mL−1的NGP-2-NPs孵育10分钟，4T1和MCF-7细胞的存活率分别显著下降至约5%和13%。根据活/死细胞染色数据，在1064 nm激光照射下，NGP-2-NPs处理的4T1细胞几乎全部死亡，碘化丙啶(PI)染色，发出红色荧光。而在不含NGP-2-NPs和/或1064 nm激光照射的其他对照组中，细胞呈现出钙黄素AM (AM)发出的绿色荧光，表明其处于活态，进一步验证了NGP-2-NPs在黑暗且强大的NIR-II激光激活的光热消融癌细胞中的细胞生物相容性。此外，NGP-1-NPs还显示出在溶酶体中的特异性积累、低细胞毒性和强大的NIR-I激光触发的癌细胞光热消除。
纳米粒子的体内光热和光声研究
在4T1荷瘤小鼠身上探讨NIR-II激活PAI和NGP-2-NPs光热消融的作用。为了实现实体瘤的活体PAI可视化，将移植瘤小鼠在PBS缓冲液(100 μL, 1 mg mL-1)中静脉注射NGP-2-NPs，通过PA计算机断层扫描系统记录不同时间间隔的PA图像。PAI结果显示，NGP-2NPs在注射后3小时开始显示肿瘤边缘，在注射后约6小时通过血液循环达到最高的被动积累，注射后24小时几乎完全排出，表明NGP-2-NPs具有相当的穿透肿瘤和靶向肿瘤的能力。另一方面，考虑到NGP-2-NPs在肿瘤部位积累最多，选择注射后6 h进行光热处理。为评价体内光热治疗效果，将4T1荷瘤小鼠随机分为PBS、激光、PBS +激光、NGP-2-NPs +激光4组。小鼠静脉注射PBS缓冲液(100 μL, 1 mg mL-1)中的NGP2-NPs，注射后6 h，激光照射1064 nm (1 W cm-2)，观察肿瘤部位温度升高情况及对肿瘤生长的抑制作用。激光照射5min后，NGP-2-NPs +激光组小鼠肿瘤温度迅速升高至约52.5℃，已超过诱导肿瘤热疗的要求(45℃)。相比之下，PBS +激光对照组的肿瘤温度在照射结束时仅轻微上升至38.5°C。红外摄像机清晰地记录了处理过程，揭示了NGP-2-NPs在NIRII光作用下的原位光热转换。值得注意的是，在三个对照组中，肿瘤始终表现出较高的生长速度。与之形成鲜明对比的是，激光照射下的NGP-2-NPs完全消除了肿瘤，在随后的14天内没有复发，证明了NGP-2-NPs具有良好的光热治疗性能。通过肿瘤活检的方法，如苏木精和伊红(H&E)染色、Ki67标记(增殖细胞标记)免疫组织化学分析和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)法，进一步检测残留肿瘤组织的凋亡和生物活性。NGP-2-NPs +激光组肿瘤细胞凋亡效果明显，表现为细胞核高度碎片化，Ki67标志物缺失，TUNEL信号强烈，而其他处理对肿瘤生长的影响可以忽略不计。这些结果表明，NGP-2-NPs可以在体内通过NIR-II响应性PTT在肿瘤区域被动积累，有效激活肿瘤凋亡。
总结
我们通过包封两亲性聚合物纳米颗粒(NGP-1-NPs和NPG-2NPs)实现了纳米石墨烯-卟啉杂化体在各种水介质中的分散，在NIR-I和NIR-II窗口中分别表现出≈1000和≈1400 nm的强吸收。NGP1-NPs和NGP-2-NPs的pce分别为60%和69%，具有良好的光稳定性和生物相容性，体外和体内均有较高的治疗效果。此外，NGP-2-NPs表现出有希望的光声响应，这使得它们在肿瘤中积累的动态过程可视化。因此，PTT可以由PAI通过NIR-II窗口引导，这是第一次使用卟啉基染料。该策略有可能应用于实现其他扩展卟啉的水分散，甚至可能是卟啉带和卟啉结合的石墨烯纳米带，为NIR-II纳米药物提供新材料。此外，这些NPs可以通过已知的方法进行表面功能化，以实现对癌细胞或神经离子通道的靶向，扩大了它们在基于NIR - ii的纳米治疗和光遗传学方面的潜力。
参考文献
A Nanographene-Porphyrin Hybrid for Near-Infrared-Ii Phototheranostics , Hao Zhao, Yu Wang, Qiang Chen, Ying Liu, Yijian Gao, Klaus Müllen, Shengliang Li,* and Akimitsu Narita*，Adv. Sci. 2024, 2309131,https://doi.org/10.1002/advs.202309131
