内容提要
开发了一种构建具有优异亮度和光稳定性的NIR-I/NIR-II纳米荧光团的综合方法。该研究首次证实了具有较强疏水部分和较弱亲水部分的两亲分子是构建更亮的纳米荧光团的优越候选分子，这是由于其在抑制分子内电荷转移/聚集引起的供体-受体-供体型荧光团的荧光猝灭方面具有更高的效率。所制备的纳米荧光团在水溶液中的荧光量子产率超过4.5%，并表现出高达1300 nm的强NIR-II尾发射。纳米荧光团的优越性能使其能够实现高分辨率全身血管成像和脑血管成像，以及体内淋巴系统的高对比度荧光成像。此外，它们在体内微小肿瘤的高灵敏度荧光检测方面的潜力已被成功证实，从而支持它们未来在癌症早期精确荧光成像引导手术中的应用。
结果与讨论
荧光分子的设计与光物理性质
为了实现设计的纳米荧光团，设计并合成了两种具有明亮NIR-I/NIR-II发射的D-A-D型小分子荧光团(NT-850和NT-950)。 NT-850和NT-950的光物理特性表明，它们都具有理想的宽发射带、高量子产率和极性敏感发射。根据理论计算结果，设计的荧光团在有机溶剂中的这种极性敏感荧光特性可归因于其特征的D-A-D型结构产生的强ICT效应。此外，NT-850和NT-950在极性溶剂(如甲醇(含10%四氢呋喃，THF))中分散时，吸收带被拓宽和红移，表明它们在这些溶剂中的溶解度有限导致了分子间聚集。同时，NT-850和NT-950在甲醇中的荧光强度与在乙醇中的荧光强度相比仅略有下降。这些结果表明，NT-850和NT-950在甲醇中的荧光减弱主要是由于溶剂化效应导致荧光猝灭，而不是聚集致猝灭(ACQ)效应。有趣的是，在水中，与在甲醇中观察到的相比，它们的荧光强度明显减弱。此外，根据NT-850和NT-950在不同水分数的混合溶剂(THF和水)中的光谱，观察到随着水分数从40%增加到60%，荧光明显下降。这伴随着一个急剧拓宽和红移的吸收带。结合水分子吸收引起的可忽略的荧光猝灭效应，我们表明，这些结果表明NT-850和NT-950在高含水量的混合溶剂中荧光湮灭除了水的溶剂化作用外，还有ACQ效应。考虑到用于生物成像的荧光探针需要在水溶液中分散，上述研究结果表明，需要减轻水引起的溶剂化和ACQ效应，以增强其生物成像应用的便便性。
荧光纳米粒子的制备和光物理性质
为了减少NT-850和NT-950在水溶液中的溶剂化和ACQ效应，采用了一种通用策略，即利用两亲性分子将上述设计的荧光团包封在水分散的纳米颗粒中。因此，我们选择了多种具有不同亲疏水成分的商业两亲分子来封装上述设计的NIR-I/NIR-II荧光团。这是为了研究制备的纳米粒子的光学性质与相应的两亲分子的化学结构之间的结构-功能关系。在不同的两亲性分子中，由PSMA和PS-PEGCOOH衍生的荧光团混合有机纳米颗粒具有强疏水性聚苯乙烯片段，与烷基链(磷脂酰胆碱、PC、DSPE-PEG2000和F-127)和蛋白质(BSA)修饰的纳米颗粒相比，荧光强度更高。此外，使用具有相同疏水基团的两亲分子(PSMA vs PS-PEGCOOH, PC vs DSPEPEG2000，以及DSPE-PEG2000 vs F-127)制备的纳米粒子，当由亲水性较强的两亲分子(PSMA的羧基和PC的季铵基)衍生时，其荧光性较弱。这些结果表明，高亮度NIR-I/NIR-II荧光纳米颗粒的优先形成涉及两亲分子，疏水部分表现出明显的疏水性，亲水部分表现出低亲水性。这种偏好可能归因于它们形成致密疏水壳的能力，有效地减少了水的溶剂化效应。与其他两亲性分子相比，PSMA是制备具有增强亮度的水分散纳米颗粒的首选材料。利用PSMA作为加载基质制备的纳米颗粒的尺寸被确定为大约150 nm。这些纳米颗粒表面羧基配体的存在可以显著增强和加速肝脏的摄取，从而限制了它们在高分辨率血管成像和肿瘤成像中的潜在应用。因此，考虑到PS-PEGCOOH在构建更小更亮的纳米荧光团方面的优越性能，以及表面聚乙二醇化能够延长血液循环时间以进行体内荧光成像的能力，我们选择52−55 PS-PEGCOOH作为负载基质，用于后续制备NIR-I/NIR-II发射纳米探针。为了进一步提高所设计纳米探针的荧光亮度，通过调整其掺杂比例，进一步研究了ACQ效应对荧光团内部纳米颗粒的影响。当纳米颗粒中染料的质量含量约为0.75%时，NT-850和NT-950掺杂的纳米颗粒都表现出优异的亮度。此外，研究结果表明，进一步增加设计的NIR-I/NIR-II荧光团在纳米颗粒内的掺杂比例，会导致掺杂的荧光团出现明显的ACQ效应，导致荧光强度明显下降。因此，以PS-PEGCOOH为负载基质，制备了以NT-850或NT-950(质量含量为0.75%)为掺杂发光中心的NIR-I/NIR-II发射纳米探针，分别命名为NT-850纳米点和NT-950纳米点。动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)表征表明，NT-850纳米点和NT-950纳米点的水动力直径分别以41 nm和49 nm为中。在水溶液中，NT-850纳米点和NT-950纳米点分别在740和825 nm处表现出不同的吸收峰，同时在802和890 nm处表现出不同的发射峰。测定NT-850纳米点和NT-950纳米点在水溶液中的荧光量子产率分别为4.5%和0.94%测定其在水溶液中的荧光寿命分别为3.31 ns (NT-850纳米点)和1.80 ns (NT-950纳米点)。与临床批准的近红外显像剂ICG相比，使用硅基CCD在800LP通道采集荧光信号时，NT-850纳米点(NT-850与ICG的浓度相当)的亮度更高。采用InGaAs CCD在不同信号采集通道(900LP、1100LP、1200LP、1300LP)采集荧光信号时，设计的NT-850纳米点和NT-950纳米点的亮度优于ICG。由于硅基CCD对900 nm以上光子的探测灵敏度降低，因此在900LP通道上使用硅基CCD采集NT-850和NT-950纳米点的荧光信号略低于ICG。此外，与ICG相比，本研究制备的NT-850纳米点和NT-950纳米点都具有更好的光稳定性。这些结果证实了NT-850纳米点在NIR-I和NIR-II荧光成像上优于ICG。
荧光纳米粒子的淋巴成像研究
利用InGaAs CCD捕获静脉给药NT-850纳米点发出的NIR-II荧光信号(1200LP)，实现了高分辨率的体内荧光成像。静脉给药NT-850纳米点后，可以清晰地观察到全身血管。此外，通过小鼠皮肤和组织，可以清晰实时地看到后肢的微小血管和动静脉血管之间的间隙。此外，通过完整的头皮和颅骨也可以清晰地观察到脑血管的毛细血管网络。优异的性能证实了NT-850纳米点在NIR-II区域利用非峰尾发射进行NIR-II荧光成像的能力。更重要的是，这些结果表明NT-850纳米点为深部组织的高分辨率(~ 120 μm)荧光成像提供了实质性的好处。为了评估NT-850纳米点对小动物高对比度荧光成像的能力，我们进一步利用制备的NT-850纳米点对小鼠进行淋巴造影。在730 nm激光激发下，将NT-850纳米点皮下注射到小鼠后肢足垫中获得荧光成像，并使用配备800LP滤光片的硅基EMCCD进行捕获，观察到注射的NT-850纳米点进入淋巴系统，并在10分钟内向腘窝和腰椎淋巴结迁移。随后，淋巴系统(包括淋巴结和淋巴管)的荧光强度在给予NT-850纳米点后30分钟内持续增加。相比临床批准协调小组在一个等效剂量,nt - 850 nanodots表现出更高的信噪比,以及淋巴系统保留时间较长(超过12小时),值得注意的是,淋巴系统的荧光信号,标签由协调小组第一2 h内迅速下降。与此同时,有一个增加荧光信号从皮肤和肝脏等地区,它没有老鼠的淋巴系统的一部分。这些结果表明，小分子ICG(小尺寸)从淋巴系统渗漏到血管中，导致淋巴系统和背景之间的对比度降低。这一限制阻碍了体内淋巴系统的长期可视化和使用ICG进行图像引导的手术导航。相比之下，NT-850纳米点标记的淋巴系统在体内一致且高对比度的荧光信号表明，NT-850纳米点从淋巴系统渗漏到小鼠其他组织的可能性很小。因此，制备的NT-850纳米点在深部组织淋巴系统的长期高对比度可视化方面具有重要的潜力，从而提高了临床图像引导下肿瘤前哨淋巴结手术的便利性和有效性。
荧光纳米粒子的肿瘤成像研究
考虑到NT-850纳米点在体内NIR-I/NIR-II荧光成像中的优越性能，以及其通过纳米探针的EPR(增强渗透性和滞留性)效应靶向肿瘤组织的能力，将制备的NT-850纳米点应用于体内肿瘤成像。体内实验采用皮下接种Ags人胃腺癌细胞建立小鼠皮下人胃癌模型。当肿瘤直径达到5mm左右时，将NT-850纳米点和ICG分别静脉注射到荷瘤小鼠体内。在NT-850纳米点和ig给药小鼠中均观察到局部区域的荧光信号，表明荧光探针在相应部位积累。根据明场图像，纳米探针注射后2小时，NT-850纳米点处理小鼠的肿瘤轮廓逐渐出现，而icg处理小鼠则没有观察到这种现象。随着时间的推移，小鼠体内ICG的积累主要集中在肝脏区域。在给予NT-850纳米点12小时后，荧光成像能够识别位于小鼠肝脏区域附近的肿瘤病变，尽管来自肝脏的强背景荧光信号产生了明显的干扰。此外，位于小鼠腹部的微小肿瘤病灶也清晰可见，表明与ICG相比，NT-850纳米点具有优越的肿瘤靶向能力，这是EPR效应的原因之一。根据明场图像和肿瘤靶向荧光成像，NT-850纳米点治疗小鼠的两个肿瘤都被成功切除，同时发现并切除了四个疑似小肿瘤组织。进一步对切除组织进行H&E染色的组织病理学分析，证实切除组织分别与肿瘤组织和淋巴结组织对应。此外，从icg治疗小鼠上切除的组织也被证实是肿瘤病变。不幸的是，虽然肿瘤病变肉眼可见，但当使用ICG作为荧光探针时，它们无法通过荧光成像识别。这些发现表明，明亮的NT-850纳米点在体内肿瘤检测方面具有良好的潜力，甚至在荧光成像引导下切除肿瘤前哨淋巴结方面具有优势。
总结
总之，我们开发了一种综合的方法来制造高发光NIR-I/NIR-II有机纳米点，利用传统的防水NIR-I/NIR-II acq型荧光团作为发射器，实现高分辨率NIR-II成像和高对比度NIR-I在体内成像。结果表明，由高疏水性的疏水片段和低亲水性的亲水片段组成的两亲性分子是构建具有增强亮度的NIR-I/NIR-II发光纳米荧光团的首选材料。这种偏好可能是由于它们能够形成致密的疏水壳，有效地降低了水的溶剂化效应。由于制备的纳米点在传统的NIR-I区域具有高亮度，且其发射尾长度超过1300 nm，并且在NIR-II区域具有部分发射，因此这些纳米点可用于高分辨率NIR-II荧光成像，如全身血管成像和体内实时脑血管成像。此外，这些纳米点在NIR-I区域的强烈主发射允许高对比度荧光成像应用，包括长期淋巴系统成像和检测活体小动物的微小肿瘤。同时，这种类型的纳米探针还具有优异的光稳定性，毒性小，在肿瘤或淋巴组织中保留时间长等显著特性。这些由D-A-D型荧光团和两亲分子制备的纳米点的优越特性将支持它们未来在癌症早期精确荧光成像引导手术中的临床应用。
参考文献
Molecular Engineering of Bright NIR-I/NIR-II Nanofluorophores for High-Resolution Bioimaging and Tumor Detection in Vivo， Xiaobo Zhou, Yiwei Fan, Shijie Li, Ke Zhang, Yuetian Pei, Yuhan Zeng, Xiaoxia Kang, Lingfeng Zhao, Hao Chen, Yuling Qin, Wei Feng,* Lingxiao Liu,* and Li Wu*，Nano Lett. 2024, 24, 1792−1800，https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c04976
