内容提要
近红外II (NIR-II)窗口的荧光成像和生物传感在无创、无辐射和快速反应的临床诊断中具有很大的前景。开发明亮的NIR-II荧光团仍然具有挑战性。在这项研究中，我们报道了一种通过分子内静电锁定来增强NIR-II聚集诱导发射(AIE)荧光团亮度的新策略。通过在TSEH分子中噻吩桥的侧链中引入硫原子，通过硫原子和氮原子之间的分子内相互作用锁定共轭主链的分子运动。这导致TSEH在溶液和聚集状态下的NIR-II荧光发射增强。TSEH包封的纳米粒子(NPs)的亮度比带有烷基侧链的TEH NPs高2.6倍。体内实验表明，TSEH NPs在血管和肿瘤成像中具有高信本比和精确切除微小肿瘤的可行性。此外，将TEH包封的聚苯乙烯纳米球用于抗原的侧流检测，在检测低浓度抗原时，其信噪比比TEH高1.9倍。这项工作强调了通过分子内静电锁定开发明亮的NIR-II荧光团的潜力及其在临床诊断和生物医学研究中的潜在应用。
结果与讨论
分子设计与合成
采用三苯胺(TPA)作为给电子单元(D)，由于其给电子能力强，结构体积较大，导致聚集状态下分子间相互作用受到抑制，阻碍分子运动。采用强吸电子基团苯并双噻二唑(BBTD)作为受体单位(A)。为了提高在水溶液中的亮度，对桥接噻吩单元的侧链进行了微调。3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)是一种广泛使用的桥接单元，在D和a之间插入以构建TE。利用具有较大空间位阻和疏水性的3-(2-乙基己基)噻吩(3EHT)取代TEH中的EDOT以减少分子间相互作用。此外，带硫原子侧链的3-((2乙基己基)硫代)噻吩(3EHTT)被引入到TSEH中，通过硫原子和氮原子之间强烈的分子内相互作用来增强骨架刚性并减少分子运动。这些分子的详细合成路线和结构特征在辅助资料中给出。
光物理性质
对TE、TEH和TSEH在有机溶剂中的吸收光谱和荧光光谱进行了测试。由于TE的分子结构更为平面化，在四氢呋喃(THF)中，其吸收峰在777 nm处延伸得最大。具有最扭曲骨架的TEH分子在691 nm处表现出最高的蓝移吸收峰。稍微不扭曲的TSEH分子有一个698 nm的吸收峰。三种分子在THF中的消光系数均大于1 × 104 M-1·cm-1。与计算结果一致，扭度越大的分子的摩尔消光系数越小。其中TE的摩尔消光系数最高，为1.96 × 104 M-1·cm-1，其分子结构相对平坦。TEH的摩尔消光系数为1.30 × 104 M-1·cm-1，而TSEH的摩尔消光系数为1.67 × 104 M-1·cm-1，介于两者之间，具有最扭曲的结构。优化后的扭转结构使TSEH的摩尔消光系数提高，有利于提高亮度。在THF中，所有三种化合物均在1050 nm以上呈现荧光峰。THF中TE和TSEH的荧光发射都很强，而TEH的荧光强度要弱得多。我们还研究了这三种分子在甲苯中的吸收光谱和荧光光谱，其吸收光谱和荧光峰与在THF中的吸收光谱和荧光峰相似。然而，与四氢呋喃溶液不同的是，由于甲苯溶液的低极性，分子与溶剂之间的相互作用显著减少，导致荧光发射增强。值得注意的是，用积分球测量了TSEH在甲苯溶液中的绝对荧光QY为5.27%±0.90%。为了证实这一绝对荧光QY值，以DCE中IR-26 = 0.05%的QY为参考，也测量了甲苯中TSEH的相对QY为5.62%。采用相对法(以甲苯中TSEH = 5.27%的QY为参照)测定THF中TE、TEH和TSEH的相对QY, QY分别为0.98%、0.22%和0.89%。染料分子被两亲性聚合物1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)包裹，并自组装成水溶性染料纳米颗粒(NPs)。检测了染料纳米颗粒在水溶液中的吸收光谱和荧光光谱。在水溶液中，染料的吸收光谱有轻微的红移，三种材料的吸收峰都超过了700 nm。包封染料的摩尔消光系数略有下降，但仍超过1×104·M-1·cm-1。染料纳米粒子在水溶液中的QY与在THF中的QY差异显著。与THF溶液相比，TE在水溶液中表现出明显的荧光猝灭，QY降至0.1%(以TSEH在甲苯中的QY = 5.27%为参照)，仅为其在THF中的QY的十分之一。水溶液中TEH和TSEH的QY均有所增加，其中TSEH的QY最高，为1.22%。根据摩尔消光系数与QY的乘积计算亮度。利用增强的ε和QY, TSEH NPs的亮度比TE NPs提高了6倍，比TEH NPs提高了2倍。
为了研究染料从THF到水溶液的QY变化，我们制备了一系列不同组成的THF/水溶液，并评估其荧光强度变化。AIE曲线所示，TE相对平面的分子骨架表现出完全的聚集诱导猝灭(ACQ)现象，在99%水分数时，其荧光强度下降到初始值的3%。这可能归因于分子聚集时强π-π堆积。相反，TEH表现出明显的AIE现象，在99%水分数下荧光增强7.5倍。与前两种不同的是，TSEH在THF溶液中表现出相当高的荧光强度，达到TE的73%，也是TEH的5.3倍。随着水分数的增加，TSEH的荧光强度首先下降，可能是由于TICT效应。当水分数达到60%后，其荧光强度显著增加，超过纯THF溶液。随后，TSEH的荧光强度继续增加，直到含水率达到99%。此时，TSEH的荧光强度是纯THF的1.4倍。我们推测这是由于硫原子的引入，产生了两对硫氮静电锁，增强了分子骨架的刚性，从而减弱了分子在溶液中的运动，达到了在溶液状态下限制分子内运动的目的。研究了三种染料分子在不同极性溶剂中的吸收光谱和荧光光谱。三种分子的吸收光谱在不同极性的溶剂中没有明显的变化。然而，随着溶剂极性的增加，这三种分子的荧光都明显降低。这表明这三种分子都具有TICT特性。在高极性溶剂中，TSEH仍表现出比TEH更强的荧光发射。这说明静电锁定效应在一定程度上抑制了TICT过程。为了进一步研究这些染料在聚集状态下的荧光特性，我们对其固体粉末的荧光强度进行了评估。虽然TE在有机溶剂中表现出最高的QY，但其在固体粉末形式下的荧光最弱。TE相对平面的结构使其更容易发生π-π堆积，在致密堆积过程中导致后续的荧光猝灭。对TEH和TEH二聚体的DFT计算表明，这两种分子具有相似的大填充距离(TEH为~3.4 Å， TEH为~3.8 Å)。这表明TEH和TSEH具有更大的侧链和更多的扭曲结构，受π-π堆积的影响较小。因此，它们在固体粉末中表现出更强的荧光。由于静电锁定效应，可以有效抑制TSEH分子的骨干旋转运动，因此与TEH相比，TSEH固体粉末的荧光强度更高。利用动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)研究了染料纳米颗粒的粒径，发现所有三种纳米颗粒的粒径分布均匀，约为100 nm。
TSEH静电锁的机理研究
噻吩桥与BBTD之间的二面角关系密切。因此，进行了分子动力学(MD)模拟，以从动力学角度进一步阐明静电锁在提高量子产率方面的作用。模拟了三种分子(TE、TEH、TSEH)在水溶液和甲苯溶液中的分子构象。基于最近50 ns MD轨迹，收集了激发态下BBTD和噻吩单元之间的二面角分布(Dih_a)。值得注意的是，具有双静电锁的TSEH分子显示出最窄的二面角分布，半最大值全宽度(FWHM)仅为8.5°，而TEH为9.8°，TE为11.5°。这些结果进一步证明了本工作引入的双静电锁可以有效地锁定BBTD与噻吩桥之间单键的旋转。在甲苯中的MD模拟得到了与在水溶液中一致的类似结果。此外，根据径向分布函数(RDFs)分析了BBTD核心周围的溶剂分子数。在水溶液中，发现TE在BBTD核心附近具有最高的水分子浓度。相比之下，由于大体积疏水性烷基和烷基硫基对BBTD核心的保护(疏水和位阻)作用，TEH和TSEH在BBTD核心周围的水分子分布大大减少。先前的研究表明，溶剂化水分子与染料分子骨架之间的相互作用也是水溶液中染料荧光猝灭的关键因素。本研究中疏水侧链的引入对提高染料在水溶液中的荧光量子产率也起着至关重要的作用。此外，与EDOT单元相比，3EHT和3EHTT具有较大的空间位阻，有助于削弱染料在聚集状态下的π-π堆积，从而减少分子间的能量传递。这也解释了为什么TE在水溶液中表现出最严重的QY降低。
为了进一步研究硫原子对烷基和烷基硫代染料中染料分子的分子运动和非辐射转变过程的影响，我们计算了TEH和TSEH分子的内部转化率(kic)，并显示了对内部转变过程有显著贡献的主要振动模式。kic越大，表明分子的非辐射转变越强，从而降低了QY。计算表明，TEH分子的总动能(5.56×108·s-1)比TEH分子的总动能(4.67×109·s-1)小一个数量级，其中TEH中BBTD m3的畸变振动模式起决定性作用。因此，在烷基链中引入硫原子可以有效地增强附近分子骨架的刚性，显著抑制分子振动(尤其是BBTD的畸变)。由于在TSEH中设计了双静电锁，使得烷基硫代TSEH的分子刚性大大提高，这对提高染料在水溶液中的QY非常有利。
体内血管成像
使用808 nm激光激发捕获NIR-II照片，显示TSEH NPs的亮度最高，分别是TEH和TE的2.6倍和6.5倍。并对制备的纳米颗粒在水溶液中的稳定性进行了评价。制备了相同浓度(0.01mg·mL-1)的染料纳米颗粒和ICG水溶液。在300 mW·cm-2 808 nm激光照射下，ICG溶液的荧光强度在60分钟后衰减到原始值的6%，而被封装的TE、TEH和TSEH纳米粒子的荧光强度基本保持不变。评价了TSEH NPs在PBS溶液中的稳定性。室温保存30天后，TSEH NPs的吸收光谱和尺寸分布没有明显变化。此外，还研究了染料纳米颗粒的组织渗透能力。通过在透明细胞培养皿中加入不同厚度的1%脂肪乳液水溶液，模拟不同厚度的人体组织。将荧光纳米粒子水溶液置于直径为1mm的毛细血管中，并紧密放置于培养皿下方。从培养皿上方侧面照射808 nm激光(19.9 mW·cm-2)，用培养皿上方近红外相机拍摄近红外成像照片。结果表明，在穿透8 mm脂肪乳后，TSEH NPs仍然具有清晰的边缘和较短的半宽(FWHM)，为6.96 mm，这表明TSEH NPs在成像深层组织器官方面具有很大的潜力。随后，将荧光团(200 μL, 1 mg·mL-1)经尾静脉注射到小鼠体内，在808 nm激发下进行血管成像，在1300 nm处采用长通(LP)滤光片成像。在同等激光功率和曝光时间下，TSEH NPs在成像过程中表现出最高的血管荧光强度，在区分直径为0.5 mm的血管和清晰识别分叉毛细血管方面表现出卓越的性能。相反，TE NPs和TEH NPs由于亮度较低，无法清晰区分毛细血管，导致背景信号模糊。通过高斯拟合计算小鼠股动脉的信本比(SBR)和FWHM。随着染料亮度的增加，成像分辨率得到有效提高。由于TSEH NPs的高亮度，其成像SBR达到4.2，几乎是TEH NPs的2倍。此外，还对小鼠的背部和侧面进行了体内成像实验。成像结果表明，TSEH NPs由于其特殊的亮度，可以在小鼠血管成像中获得更多的细节。与腹部的成像效果一致，TSEH NPs可以清晰地分辨出更详细的血管。高亮度、稳定性和组织穿透能力使TSEH NPs成为各种生物医学成像应用的有希望的候选者。
NIR-II窗口下的体内成像引导小肿瘤消融手术
受明亮的TSEH NPs在血管成像中的卓越表现的鼓舞，我们设想TSEH NPs在肿瘤成像中也应该表现出良好的表现。为了增强纳米颗粒的肿瘤靶向能力，利用肽ArgGly-Asp (RGD)修饰纳米颗粒。首先用DSPEPEG-MAL包封TSEH得到马来酰亚胺(MAL)修饰的纳米颗粒，然后通过氨基RGD连接合成AIEgen TSEH@RGD。Zeta电位测试显示TSEH@RGD的表面电位略高于TSEH NPs，分别为-3.1 mV和-20.8 mV。微负电位表明RGD在纳米颗粒表面修饰成功。我们通过共聚焦成像实验来评估TSEH@RGD选择性4T1肿瘤细胞靶向能力。由于TSEH@RGD在共聚焦显微镜下无法显示，我们将TSEH和商用染料FITC共包被，生成TSEH-F@RGD和TSEH- f NPs(不含RGD)，它们发出绿色荧光。4T1细胞和HeLa细胞与TSEH-F@RGD和thh - f NPs共培养，并与Hoechst商用核染色(蓝色荧光)染色效果进行比较。如图5c所示，当用TSEH-F@RGD对4T1细胞进行染色时，大部分细胞核被染成蓝色，胞质中有明显的绿色荧光，说明TSEH-F@RGD可以被4T1细胞有效占用。与此相反，用teh - f NPs染色时，许多细胞的细胞质显示微弱的绿色荧光，有些细胞的细胞质不发出任何荧光。这表明与teh - f NPs相比，TSEH-F@RGD更容易被4T1细胞吸收。当对HeLa细胞进行染色时，TSEH-F@RGD和teh - f NPs的结果类似，细胞质中没有或微弱的绿色荧光。这表明HeLa细胞对TSEH-F@RGD和teh - f NPs的摄取率都很弱。结合4T1细胞的染色实验，可以得出RGD修饰有效增强了4T1细胞对纳米颗粒的选择性摄取率，从而使TSEH-F@RGD能够有效靶向4T1肿瘤进行成像。利用流式细胞术(FCM)定量研究TSEH-F@RGD对4T1肿瘤细胞的靶向能力。显示TSEH-F@RGD在4T1细胞中与teh - f NPs的荧光强度有显著差异，而在HeLa细胞中则无差异，进一步证实了TSEH-F@RGD对4T1荷瘤的靶向能力。
生物体内小肿瘤的检测对于癌症的早期诊断至关重要。然而，由于大荧光团的低吸收和显著的几何阻力，诊断微小肿瘤(小于1mm)仍然很困难。因此，迫切需要能够在小肿瘤中更好地积累的有效探针。受TSEH-F@RGD 4T1肿瘤细胞靶向能力阳性结果的启发，我们对小鼠皮下肿瘤进行了NIR-II成像实验。建立两组小鼠皮下肿瘤模型，分别经尾静脉注射TSEH@RGD和TSEH NPs (200 μL, 1 mg·mL-1)。在不同的时间间隔拍摄NIR-II荧光图像，并分析成像结果。随着时间的推移，AIEgen在肿瘤区域逐渐积累，肿瘤亮度先升高后降低，在24 h达到峰值。瘤正常比(TNR)也呈现先升高后降低的趋势，其中TSEH@RGD的TNR在12 h达到峰值。在比较TSEH@RGD和TSEH NPs的成像效果时，靶向TSEH@RGD的肿瘤堆积明显增加，从而增加了肿瘤成像的TNR。TSEH@RGD成像的肿瘤亮度几乎是非靶向TSEH NPs的两倍。基于TSEH@RGD在皮下肿瘤成像中的优异效果，我们认为它在肿瘤原位成像和手术导航方面具有很大的潜力。建立肺转移模型，经尾静脉注射TSEH@RGD进行NIR-II成像。注射后1小时，侧视图可见明显的肝、脾信号。肺区可见明显肿瘤信号。在第6小时侧视图成像中，可以看到肺肿瘤荧光由多个亮点组成，在第18小时侧视图和俯视图上，肿瘤信号进一步增强。接下来，在NIR-II荧光成像的指导下，分别去除多个荧光组织。从肺中分离出5个肿瘤组织，最小的肿瘤组织直径小于1mm，说明TSEH@RGD对于小直径肿瘤组织具有很好的分辨率。苏木精和伊红(H&E)染色证实组织为肺肿瘤组织。在俯视图中从头部位置分离一块肿瘤组织，H&E染色证实该组织为肺肿瘤转移源性肿瘤组织。手术切除后，相应位置的荧光信号明显减弱。这些结果表明TSEH@RGD对肿瘤组织具有优异的成像性能，特别是对小直径(< 1 mm)肿瘤组织的分辨能力，显示了TSEH@RGD在成像引导下切除手术中的巨大潜力。
总结
本研究提出了一种独特的方法，通过引入分子内静电锁定，构建具有显着亮度的新型NIR-II AIEgen TSEH，来提高NIR-II AIEgen的亮度。在噻吩桥架侧链上引入硫原子可以改变桥架单元上的电荷分布，导致噻吩桥架与BBTD单元之间建立两个静电锁。这些静电锁有效地限制了有害的分子内振动，减少了溶液态和聚集态的非辐射衰变。与基于共价键的熔融环体系相比，这种通过非共价相互作用增强分子骨架刚性的策略具有易于合成的优点。TSEH纳米颗粒在水溶液中表现出令人印象深刻的量子产率为1.22%，亮度为105，明显优于具有烷基侧链的纳米颗粒。TSEH纳米颗粒在体内的NIR-II生物成像显示血管成像的SBR为4.2，有利于原位成像引导的肿瘤切除。随着亮度的增强，TSEH纳米球在抗原检测中也表现出很高的灵敏度，在抗原浓度为0.01 ng·mL-1时，信号背景比达到了2.05。这些研究结果表明，分子内静电锁定在提高NIR-II AIEgens亮度方面是非常有效的，为开发明亮的NIR-II AIEgens提供了新的途径，并促进了其在体内生物成像和离体生物传感中的转化应用。
参考文献
Unlocking the NIR-II AIEgen for High Brightness through Intramolecular Electrostatic Locking ，Xinyuan Wang,Xueqin Yang,Guanyu Jiang, Zhubin Hu,Tao Liao,Guoxin Wang, Xun Zhang,Xinyuan He, Jianyu Zhang, Jianquan Zhang, Wuke CaoKaizhen Zhang,Jacky W. Y.Lam,Jianwei Sun,* Haitao Sun,* Yongye Liang,* and Ben Zhong Tang*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202404142，https://doi.org/10.1002/anie.202404142
