内容提要
急性肺损伤(ALI)提出了重大和不断升级的医疗挑战，其中准确的诊断和及时的干预对于阻止其恶化至关重要。然而，由于缺乏精通实时诊断和有效缓解急性脑损伤的代理人，持续存在障碍。在这里，设计了一个生物催化和第二个近红外(NIR-II)荧光照明纳米平台，同时促进ALI的实时监测和强大的炎症缓解。本研究首先开发了一种具有三氟甲基取代的聚集体致发光材料，同时提高了NIR-II的发射波长和荧光亮度。分子探针进一步集成到生物催化的空心二氧化铈纳米结构中，并被预激活的巨噬细胞膜覆盖，用于靶向炎症干预。吸入给药后，治疗性纳米药物利用明亮的NIR-II发射和活跃的促炎特性对ALI进行体内敏感的NIR-II成像，这也有助于实时跟踪纳米药物在肺炎环境中的分布和动态命运。同时，纳米平台的催化能力有效清除多余的活性氧，抑制促炎细胞因子，促进巨噬细胞再极化，大大减轻急性肺损伤。多层面的纳米平台集成了NIR-II生物成像和纳米催化介导的免疫调节，为解决急性炎症疾病带来的复杂挑战提供了一种多功能和有前途的方法。
结果与讨论
高发光NIR-II AIEgen的设计与合成
常规荧光团通常会遇到聚集引起的猝灭问题，导致荧光亮度降低。作为一种替代方案，AIE发光源(AIEgens)已经成为一类有前途的发射器，在聚合状态下表现出高度明亮的发射，并代表了生物医学成像应用的有利候选者。AIEgen的工作机制在于对分子运动的限制，这为分子设计提供了有价值的见解。虽然NIR-II光源已经获得了大量的关注，但那些具有明亮，长波长的NIR-II发射的光源的开发仍然是一个持续的挑战。在窄带隙有机荧光团的情况下，亮度往往经历一个显着的下降与响应波长的色移。值得注意的是，对于NIR-II发色团，当电子带隙变窄时，非辐射衰减通常变得更加明显。因此，荧光亮度与长波NIR-II光谱响应之间存在矛盾关系。在这项工作中，我们提出了一种新的策略，通过加入吸电子的三氟甲基(TFM)替代品来同时提高NIRII AIEgen的亮度和发射波长。我们首先设计并合成了两种供体受体(D-A)型化合物，分别以辛基三苯胺(OTPA)和噻二唑喹啉(TQ)为供体和受体单位。由于OTPA和TQ具有很强的给电子和吸电子特性，可以期望具有高效ICT效应的低带隙发色团。合成了两种类似物，即TT-H和TT-F，它们在TQ基团中具有不同的取代基(即氢和TFM)，并进行了系统比较。，关键的合成步骤包括monotrityltin OTPA与二溴二硝基苯并噻唑之间的still -偶联反应，然后是铁催化还原反应，然后是与苯基衍生物的环化反应，得到目标化合物。通过密度泛函理论(DFT)计算来阐明分子的几何结构和电子结构。最高占据的分子轨道(HOMO)沿整个分子分布，而最低未占据的分子轨道(LUMO)主要位于接受电子的TQ段，这表明分子内的电荷转移效应很有效。TT-H和TT-F的电子带隙分别为1.63和1.56 eV。较窄的TT-F带隙预计会导致较长的波长响应。
我们随后研究并比较了化合物的光物理性质。TT-H和TT-F在THF中的最大吸收和光致发光波长分别为676/916 nm和705/943 nm。在TT-F的响应光谱区域中观察到的色移可以归因于TFM的强吸电子特性，从而导致更有效的ICT效应和更小的带隙。为了研究不同聚集状态下的发射特性，我们监测了不同水馏分(fw)的THF/水混合物中的PL光谱。随着fw的逐渐增大，TT-H和TT-F的PL强度在fw = 30% ~ 40%时开始下降，这可能是由于在高极性环境中形成了扭曲的ICT (TICT)态。进一步增大fw值，PL强度增强，为典型AIE特征。有趣的是，TT-F的AIE振幅大大超过TT-H，这可能归因于引入了自由旋转的TFM替代品，以促进更有效地消耗激发态能量。在1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n-甲氧基(聚乙二醇)- 2000 (DSPE-PEG2000)的辅助下，采用纳米沉淀法将这两种化合物进一步配制成稳定的NPs。所得HNPs和FNPs分别在677/880 nm和717/920 nm处具有最大的吸收/PL。有趣的是，与HNPs相比，FNPs的亮度增加了2.5倍以上，这可能归因于更明显的AIE特征。TFM替代物可能诱导分子更加扭曲，减少分子间的猝灭相互作用，如分子间的堆叠，从而导致更明显的AIE特征。FNPs的PL激发图显示其具有近红外激发和NIR-II荧光。总之，这些结果表明，在D-A型分子中引入强吸电子TFM基团可以增强ICT效应，从而导致更长的波长响应。同时，自由旋转的TFM替代物促进了激发态能量的有效消耗，降低了猝灭效应，从而增强了AIE特征和荧光亮度。因此，在缺电子单元中引入TFM是一种很有前途的策略，可以同时增强NIR-II发射体的响应区域和荧光亮度。
HCe-TTF@M的合成与表征
在本研究中，采用牺牲模板的方法合成了均匀中空的CeO2 NPs。首先通过外延生长方法制备了具有均匀球形形貌和小于100 nm尺寸的病毒样介孔二氧化硅NPs，并将其用作模板。随后通过沉淀法将氢氧化铈前体应用于病毒样二氧化硅模板表面。然后用氢氧化钠(NaOH)煅烧和蚀刻二氧化硅模板，得到均匀中空的介孔CeO2 NPs(简称HCe NPs)。透射电子显微镜(TEM)检查HCe NPs的形貌，发现其具有独特的球形中空结构，具有高表面积。动态光散射(DLS)分析表明，HCe NPs的平均水动力直径为≈97.9±8.7 nm。x射线衍射(XRD)分析证实，HCe NPs表现出与CeO2标准粉末衍射文件相同的衍射模式(图S16, Supporting Information)。根据brunauer - emmet - teller方法计算出HCe NPs的比表面积为243.15 m2 g−1高比表面积有利于其生物催化能力。根据氮气吸附-解吸等温线测量，HCe NPs的孔径为≈3.91 nm。这些中空和介孔框架使它们有望用于成像探针负载。NIR-II探针TT-F加载后，得到的HCe- ttf具有与空心HCe NPs相似的水动力直径(图S17，支持信息)。HCe-TTF在吸收光谱中显示出与探针对应的明显峰，证实探针加载成功。根据吸收光谱得出的校准曲线，计算出探针的加载效率为29.6±0.7%。此外，HCe-TTF显示出与分子探针相似的PL光谱，表明HCe-TTF有可能进一步在体内进行NIR-II荧光成像。与相同TT-F浓度下以DSPE-PEG为载体矩阵形成的FNPs相比，HCe-TTF的PL强度有所增加。这种增强可能是由于当被包裹在HCe纳米载体中时，aigens的分子运动受到了更大的限制。为了增强NPs在生理环境中的稳定性，并赋予其对肺炎的特异性靶向能力，我们使用巨噬细胞膜来掩盖HCe-TTF NPs。最近，人们对将合成NPs与天然细胞膜结合起来创建仿生平台非常感兴趣，这使得NPs能够模仿这些膜起源的细胞的功能。ALI的一个共同特征是炎症的肺泡上皮细胞上调细胞间粘附分子1 (ICAM-1)，这可能有助于招募巨噬细胞等免疫细胞表达其同源配体巨噬细胞-1抗原(MAC-1)。为了利用这种自然发生的相互作用，因此制备了仿生巨噬细胞膜包裹的NPs。最初，通过脂多糖(lipopolaccharide, LPS)预处理活化RAW264.7细胞，目的是增强巨噬细胞膜的炎症归巢能力。RAW264.7细胞与浓度为100 ng mL−1的LPS孵育12 h后，通过细胞裂解和差速离心提取细胞的质膜。值得注意的是，与天然RAW264.7细胞膜相比，经western blot分析证实，lps刺激的RAW细胞获得的膜具有更高的粘附配体表达水平，如MAC-1。这种粘附配体的上调可能潜在地增强了巨噬细胞膜在炎症肺中的积聚能力。
膜覆盖的HCe-TTF NPs (HCe-TTF@M)是用先前制备的HCe-TTF NPs反复挤压新鲜收获的巨噬细胞膜制备的。根据DLS测量，得到的HCe-TTF@M的平均直径为113.9±10.1 nm，比未包被的NPs大约16 nm，尺寸的增加与细胞膜的厚度一致。TEM图像揭示了壳核结构，膜涂层包裹着NP核。利用能量色散x射线分析确定了纳米体系的元素组成。HCe-TTF NPs中明显的Ce和O信号证实了ceo2基纳米载体的存在，而F代表了NIR-II发光材料的典型元素。经过细胞膜伪装后，HCeTTF@M的zeta电位从−25 mV增加到−19 mV，接近细胞膜电位。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)仔细检查HCe-TTF@M的蛋白质谱，显示与巨噬细胞膜的蛋白质谱密切匹配(支持信息)。Western blotting分析进一步证实了表面标记蛋白(F4/80和CD86)以及关键的粘附配体如MAC-1的存在，这些配体遗传自HCeTTF@M上的M1巨噬细胞膜。总之，这些发现表明巨噬细胞膜包被NPs的成功构建。此外，HCe-TTF@M的激发-发射图显示，它们可以被700 - 800 nm范围内的光激发，而在900 - 1000 nm范围内表现出明亮的NIR-II发射。在激光照射20 min期间，HCe-TTF@M的PL强度几乎没有下降，说明HCe-TTF@M具有良好的光稳定性。研究了HCe-TTF@M的胶体稳定性。当在PBS中孵育时，在7天的时间内观察到HCe-TTF@M的水动力尺寸变化可以忽略不计，显示出良好的胶体稳定性。相比之下，没有细胞膜涂层的HCe-TTF在PBS中迅速凝聚成400-600 nm的尺寸，不能满足体内应用的要求。这些结果表明，细胞膜包衣可以提高HCe-TTF NPs在生理环境中的稳定性。
HCe-TTF@M的生物催化酶模拟活性
随后，我们深入研究了HCe-TTF@M的生物催化酶模拟活性。通常，CE基NPs可以表现出超氧化物歧化酶(SOD)样和/或过氧化氢酶(CAT)样活性，这取决于Ce3+与Ce4+的比例。特别是，SOD催化体内普遍存在的自由基超氧化物(O2•−)转化为过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)，而CAT则负责将H2O2(一种强效且有害的氧化剂)降解为水和氧气。高Ce4+比的Ce NPs往往表现出较强的CAT活性，而高Ce3+比的Ce NPs可以增强SOD活性。我们的x射线光电子能谱(XPS)分析显示，HCe-TTF@M表面的铈的化学价态是三价和四价的混合物，Ce3+/Ce4+的比值为1/5。标记为“U”和“V”的峰分别代表Ce 3d3/2和3d5/2自旋轨道峰。双重态(V, U)， (V″，U″)和(V′，U′)对应Ce4+的不同状态，而双重态(V′，U′)则表示Ce3+。这种价态组合使HCe NPs能够有效地清除O2•−和H2O2，使其成为出色的抗氧化剂。此外，当Ce4+的比例较高时，本文制备的HCe-TTF@M将表现出明显的CAT样活性。值得注意的是，优异的CAT类活性对HCe NPs的抗氧化性能至关重要，这确保了HCe NPs能够有效分解炎症微环境中存在的H2O2和模拟sod过程中产生的H2O2。
代表性的ROS参与炎症，如肺炎，主要包括H2O2, O2•−和•OH。因此，研究人员测定了HCe-TTF@M对H2O2、O2•−和•OH的活性氧清除能力，以评估其作为抗氧化纳米药物的潜力。HCe-TTF@M的cat样活性首先通过使用氧电极在不同时间点监测H2O2催化分解产生的氧气来证实。在H2O2 (5 mM)和HCe纳米配方的存在下，在生理pH条件(pH≈7.4)下观察到快速产氧。在相同的Ce浓度下，HCe-TTF@M与HCe NPs产生了几乎相同数量的氧气，这表明它们具有类似cat的活性。这一结果表明，由于小分子能够自由地穿过稀疏的磷脂双分子层，NPs在加载成像探针并涂覆细胞膜后，清除h2o2的活性基本保持不变。此外，使用过氧化氢测定试剂盒评估NPs对H2O2的催化消耗。HCe NPs、HCe- ttf和HCeTTF@M均表现出较高的H2O2清除效率。这种强大的CAT活性不仅赋予HCe-TTF@M强大的H2O2消除能力，而且还产生O2，这可能作为一种潜在的驱动力，增强纳米药物对肺组织的渗透。随后，使用商用超氧化物歧化酶测定试剂盒(WST-1)检测SOD样活性，其活性与其可以消除的O2•−的数量直接相关。HCe NPs、HCe- ttf和HCe-TTF@M均表现出较高的O2•−消除效率。
•OH是另一种高氧化性和毒性的活性氧，能够在体内破坏多种生物分子。然而，没有专门的天然酶来消除•OH。因此，具有•OH清除能力的纳米药物在对抗ROS积累方面具有独特的优势。使用MB作为•OH指标评估HCe-TTF@M清除•OH的能力。当芬顿反应产生•OH存在时，MB的吸光度迅速下降。值得注意的是，基于hce的纳米配方可以保护MB免受•OH引起的降解，这表明它们具有出色的•OH清除能力。定量分析表明HCe-TTF@M具有较强的•oh清除活性，其清除效率为73.01±3.35%，与HCe NPs相当。总的来说，HCeTTF@M对三种具有代表性的活性氧具有强大的清除活性，是一种高效、广谱的活性氧清除剂。此外，ROS清除过程并未影响HCe-TTF@M的NIR-II荧光性能，表明NIR-II探针具有强大的稳定性。这些发现表明HCe-TTF@M可以作为一种多功能抗氧化纳米催化剂，用于治疗氧化应激相关疾病，同时实现生物成像和实时自我监测。
HCe-TTF@M的体外靶向、抗炎和免疫调节能力
然后，我们将注意力集中在检查HCe-TTF@M对炎症细胞的靶向能力上。本研究利用炎症肺泡上皮细胞与巨噬细胞之间的结合亲和力，制备了仿生巨噬细胞膜包裹的NPs。为了验证我们的设计，首先用LPS刺激人肺上皮BEAS-2B细胞以激活炎症。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像显示，未经LPS诱导的BEAS-2B细胞显示弱表达ICAM-1。相比之下，lps刺激的BEAS-2B细胞中ICAM-1的表达水平明显升高。结果表明，促炎信号存在时，肺泡上皮细胞上的ICAM-1表达上调，与既往研究结果一致。为了评估NPs与肺泡上皮细胞的结合，制备了标记为HCeTTF@M的荧光染料(3,3 ' -二烯油基氯代碳青碱过氯酸盐，DiO)。作为对照，制备了用聚乙二醇(PEG)修饰的HCe-TTF NPs，而不是细胞膜涂层(指定为HCe-TTF@PEG)。所有NPs分别与天然BEAS-2B细胞或lps刺激细胞孵育4 h，然后在CLSM下成像。用HCe-TTF@M孵育的活化细胞检测到明亮的荧光信号。相反，与HCe-TTF@M相比，未涂覆巨噬细胞细胞膜的对照组HCeTTF@PEG与炎症的BEAS-2B细胞的结合减少，这表明被巨噬细胞膜覆盖的NPs对炎症上皮细胞的结合能力增强。为了揭示HCe-TTF@M优越靶向能力的机制，在NP处理之前，将炎症细胞与游离抗ICAM-1预孵育30分钟，以阻断ICAM-1结合位点。用抗ICAM-1预处理细胞后，NP结合水平显著降低，提示HCe-TTF@M与炎症细胞的结合可能是通过巨噬细胞膜上的ICAM-1与其配体(MAC-1)的特异性相互作用介导的。此外，对于未活化的天然细胞，观察到微弱的NP荧光，这与ICAM-1在天然细胞上的低表达一致。lps激活的BEAS-2B细胞，HCe-TTF@M处理后的荧光强度分别比HCe-TTF@PEG处理和HCeTTF@M处理的原生细胞高约3.33倍和2.71倍。我们使用流式细胞术分析进一步评估了不同NPs与炎症细胞的结合亲和力。流式细胞术结果与CLSM图像观察结果一致。这些数据证实了HCe-TTF@M的炎症细胞靶向能力。ALI微环境中ROS浓度升高可引发一系列有害过程，如脂质过氧化、蛋白质变性和DNA损伤，从而诱发长期肺功能障碍。以RAW264.7细胞为例，研究了HCe-TTF@M的胞内抗氧化能力。首先，我们使用噻唑蓝溴化四唑(MTT)测定法评估了各种纳米制剂的细胞毒性。RAW264.7细胞与不同浓度的HCe NPs、HCe-TTF@PEG、HCe-TTF@M孵育相比，细胞活力没有明显降低，表明这些纳米系统具有良好的生物相容性。随后，用LPS刺激RAW264.7细胞，诱导细胞内ROS水平升高，然后用不同的NPs孵育。以2’7’二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)为ROS指示剂，观察细胞内ROS水平。DCFH-DA与ROS反应后，可由非荧光化合物转化为具有绿色荧光的2’，7’-二氯荧光素。CLSM图像显示，lps激活的RAW264.7细胞中有强烈的绿色荧光信号，表明ROS水平升高。然而，lps刺激的RAW细胞与HCe NPs或HCe-TTF@PEG共孵育导致ROS荧光信号适度减少，证实了活细胞内空心二氧化铈纳米结构清除ROS的能力。有趣的是，单独的无NP核的巨噬细胞膜源性空囊泡(简称MNPs)也表现出一定的ros还原能力，这可能归因于细胞膜对促炎介质的固有吸收特性。值得注意的是，HCe-TTF@M处理的细胞显示出最明显的ROS荧光降低，这突出了hce介导的ROS消耗和细胞膜在有效降低细胞ROS水平方面的协同作用。定量荧光强度数据进一步表明，HCeTTF@M孵育细胞中的ROS水平分别比PBS、HCe NPs、HCeTTF@PEG或MNPs处理的炎症细胞低8.41-、2.64-、3.42-或4.02倍。发现HCe-TTF@M-treated细胞中的ROS水平接近天然细胞的基础ROS水平，突出了HCe-TTF@M强大的ROS清除能力。通过钙黄蛋白/PI细胞活力测定进一步评价HCeTTF@M的细胞保护作用。纳米配方处理明显抑制H2O2诱导的细胞死亡，特别是HCeTTF@M-treated细胞。这些结果表明HCeTTF@M能够保护细胞免受ros诱导的氧化损伤，这与其出色的ros清除能力是一致的。由于ROS是重要的促炎介质，它们的过量产生会导致促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-延迟(TNF-延迟)、白细胞介素-1时延(IL-1时延)和白细胞介素-6 (IL-6)的细胞水平升高。因此，我们预计清除ROS会减轻促炎细胞因子的表达。在用各种NPs处理炎症细胞后，收集上清液，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测量炎症细胞因子的浓度。HCeTTF@M处理有效地减弱了TNF-时延、IL-1时延和IL-6的分泌，并且与其他NPs处理的细胞相比，HCe-TTF@M处理的细胞TNF-时延、IL-1时延和IL-6的浓度最低。
HCe-TTF@M的体内分布和NIR-II FL生物成像
在确认HCe-TTF@M的体外生物活性后，我们接下来试图评估HCe-TTF@M在活体肺炎小鼠中的体内分布和治疗效果。虽然抗氧化纳米催化剂为炎症管理提供了一种很有前途的工具，但纳米剂对疾病病变的无效靶向以及缺乏成像工具来无创地跟踪其给药后的命运(例如，分布和保留)，提出了两个重大挑战，这通常会导致不良副作用并损害治疗益处。有了靶向炎症的巨噬细胞膜涂层，我们认为HCe-TTF@M可以在肺输送后表现出更好的结合和保留能力。此外，利用分子探针优异的光学特性，可以通过NIR-II荧光成像可视化纳米系统在体内的分布。T为了验证我们的假设，我们首先通过将LPS以0.5 mg kg−1的剂量直接气管内注射到肺中，建立了小鼠急性肺炎模型。
通过苏木精和伊红(H&E)染色的组织学检查，证实ALI模型建立成功。为了精确给药，在小鼠实验中采用微喷雾器来模拟患者使用喷雾器的自发吸入。首先，选择台锥蓝溶液作为指示剂，并使用微喷雾雾化器沿气管输送，以演示气溶胶的成功施用。然后通过微喷雾雾化器给药不同的NPs，观察其NIR-II生物成像性能和生物分布。在微喷雾器雾化HCe-TTF@M后的一个小时内，来自纳米探针的强大的NIR-II荧光信号渗透到整个肺组织。在随后的48小时内，HCe-TTF@M处理小鼠的NIR-II荧光缓慢下降，即使在气溶胶给药48小时后仍可检测到，证实其在炎症肺中的高度积聚和滞留。相比之下，非靶向HCe-TTF@PEG小鼠的肺NIR-II荧光信号在12小时后迅速减弱，几乎消失。结果突出了主动靶向在促进大量肺结合和保留中的关键作用。此外，ALI小鼠炎症肺的荧光强度与健康小鼠的荧光强度也有明显差异。HCe-TTF@M在急性肺炎小鼠的炎症肺中比在正常小鼠的健康肺中表现出更强的信号和持续的存在。增加的结合和延长的滞留可能归因于巨噬细胞膜包裹的纳米探针与炎症肺泡上皮细胞之间的强相互作用。为了进一步证明NIR- ii荧光在肺组织生物成像和监测方面比传统NIR- i成像的优势，还制备了装载fda批准的近红外染料吲哚菁绿(ICG)而不是TT-F的纳米陶瓷，并命名为HCe-ICG@M。吸入HCe-ICG@M后，在NIR-I荧光成像下观察到微弱信号，这对于长期监测肺组织中NPs的命运是有问题的。相比之下，HCe-TTF@M介导的NIR-II成像在肺组织中的分辨率和亮度明显提高，表明本文开发的NIR-II纳米探针具有优越的生物成像性能。为了进一步验证体内NIR-II成像结果，我们在给药后48 h处死小鼠，收集其肺和其他主要器官进行离体荧光成像。与HCe-TTF@PEG-treated小鼠的肺部相比，HCe-TTF@M小鼠的肺部显示出更亮的荧光。定量比较显示，HCe-TTF@M处理肺炎小鼠肺部的平均荧光强度分别比HCe-TTF@M-treated健康小鼠和HCe-TTF@PEG-treated肺炎小鼠高4.12倍和3.54倍。离体成像结果证实了活体小鼠实时NIR-II成像发现，清楚地表明HCe-TTF@M在炎症肺中的结合和保留能力增强。此外，HCe-TTF@M-treated小鼠肺组织的荧光信号在所有主要器官中最高。作为比较，HCe-TTF@M也通过传统的静脉注射给药给小鼠，由于NPs被肝脏网状内皮系统摄取，导致NPs在肝脏中主要分布。这一结果表明，肺传递的炎症靶向HCe-TTF@M可以有效、直接地在肺中积累，同时最大限度地减少NP在其他正常器官中的暴露。最后，对肺组织进行切片，检测HCe-TTF@M的组织穿透行为。如图6e,f所示，与其他实验组相比，dio标记HCeTTF@M组不仅在炎症肺组织中表现出明显更强的信号，而且信号分布更分散。在生物催化过程中，HCe-TTF@M产生O2，推动NP运动，快速浸润到肺炎深部组织。总的来说，这些结果强调了HCe-TTF@M作为一个有前途的肺炎治疗纳米平台的巨大潜力，其卓越的靶向效率、深度组织渗透以及基于NIR-II成像的自跟踪特性。
HCe-TTF@M改善ALI小鼠肺损伤
急性呼吸窘迫综合征及其引起的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是全球高死亡率的原因之一，但目前对急性呼吸窘迫综合征/ARDS的治疗并不令人满意。先前的研究表明，ALI/ARDS与导致持续肺部炎症和损伤的ROS水平不调节密切相关。建立lps诱导的急性肺炎模型，以评估具有良好炎症靶向性和强ros清除能力的纳米平台是否可以作为ALI的有效治疗方法。LPS诱导的ALI是一种有价值的小鼠ALI模型，与人类ALI具有多种病理生理相似之处。将ALI小鼠随机分为三组(每组5只)，分别用微喷雾器给药PBS、HCe-TTF@PEG和HCe-TTF@M。同时，以健康小鼠为对照,小鼠在给药48 h后安乐死。肺组织照片显示急性肺炎引起明显的病理改变，PBS治疗的ALI小鼠出现严重的充血和水肿。与此形成鲜明对比的是，HCe-TTF@M治疗明显减轻了这种病理性损伤，呈现出更正常的粉红色。此外，我们还评估了肺组织的湿/干比，以衡量肺水肿的程度。与ALI小鼠相比，HCe-TTF@M治疗导致肺组织湿/干比明显降低，这表明HCe-TTF@M有效缓解了肺水肿。然后通过分析治疗结束时小鼠肺组织中的ROS水平来评估不同纳米系统的体内ROS清除能力。使用双氢乙啶(DHE)作为检测超氧化物和过氧化氢的荧光探针，我们发现与健康对照组相比，ALI小鼠肺组织中ROS表达明显升高。在HCe-TTF@PEG或HCe-TTF@M治疗后，观察到ROS水平显著下降。特别是，HCe-TTF@M处理显著降低了肺内的ROS水平，氧化DHE探针发出的亮红色荧光大幅减少证明了这一点，强调了HCe-TTF@M强大的ROS清除功效。
同时对肺组织进行切片并进行H&E染色，以验证肺组织的病理状况。[81]如代表性的H&E图像所示，PBS处理的ALI小鼠的肺表现出明显的病理改变，包括肺泡壁增厚、弥漫性细胞损伤和炎症细胞的广泛浸润，这些都是急性肺炎的典型标志。虽然HCe-TTF@PEG的使用部分减轻了肺部病理，但明显的免疫细胞浸润和肺泡损伤持续存在。有趣的是，HCe-TTF@M治疗导致肺组织免疫细胞浸润最小，支气管周围增厚可忽略不计。pbs处理的ALI小鼠的肺组织病理学评分显示明显的肺损伤，评分范围从3到4，而HCe-TTF@M治疗显著改善了肺损伤，导致平均组织病理学评分为1到2。这些结果表明HCeTTF@M在缓解ALI方面有显著的疗效
此外，通过分析促炎细胞因子，评价HCe-TTF@M对ALI小鼠的治疗效果。已知在肺炎中，被激活的巨噬细胞会过度表达关键的促炎细胞因子，包括TNF- rtp、IL-1 - rtp和IL-6，其水平与ALI的进展密切相关。治疗结束时，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，采用ELISA法定量测定TNF- r0、IL-1 - r0、IL-6。
结论
总之，我们已经推出了一种吸入式生物催化治疗纳米平台，该平台无缝集成了主动炎症靶向、实时NIR-II荧光成像、有效炎症抑制和免疫调节，用于ALI的精确诊断和治疗。我们首先战略性地合成了一种新型的高发光AIE剂，该剂在NIR-II区显示出最大的亮发射。我们证明了在缺电子单元中引入三氟甲基取代代表了同时增加NIR-II发射体的响应区域和荧光亮度的有希望的策略。该治疗平台是通过将NIR-II分子探针纳入中空的二氧化铈纳米载体中，并进一步包裹巨噬细胞来源的细胞膜，以增强其向炎症肺的倾向。空心二氧化铈纳米载体同时具有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶模拟酶活性，催化消耗多种类型的活性氧以减轻炎症，并产生O2气体促进NP运动以快速组织浸润。将无创气溶胶吸入急性肺炎小鼠模型后，巨噬细胞膜覆盖的纳米催化剂通过仿生相互作用引导和自我推进运动将探针快速运送到发炎的肺部。实时NIR-II荧光成像显示了纳米探针对ALI敏感检测的熟练程度，同时有助于长期跟踪NP的分布和动态命运。同时，由于抑制氧化应激、下调炎症细胞因子、改善肺水肿和促炎巨噬细胞复极化的协同作用，纳米系统显示出显著缓解肺部病理和症状而不诱导全身毒性。这项工作首次将高性能NIR-II成像探针与纳米催化介导的免疫调节结合起来，用于ALI的实时诊断和干预，为开发多功能生物催化成像工具，用于多种呼吸系统疾病的高级管理提供了新的视角。
参考文献
Inhaled NIR-II Nanocatalysts for Real-Time Monitoring and Immunomodulatory Therapy of Acute Lung Injury ，Yi Li, Dongfang Liu, Ting Chen, Jianwen Song, Xuya Yu, Qian Liu, Ji Qi,* and Wen Li*，Adv. Funct. Mater. 2024, 2403183，https://doi.org/10.1002/adfm.202403183
