内容提要
需要高光稳定性的荧光应用通常依赖于使用溶液添加剂来增强荧光团的性能。本研究表明，环己四烯(COT)、4-硝基苯基醇(NBA)或Trolox与菁荧光团Cy5的直接或近端偶联显著增强了荧光团的光稳定性，而不会影响其固有的光谱特性。这种偶联是提高基于荧光的应用的有力手段，要求长寿命，不闪烁的荧光发射。
结果与讨论
体外单分子研究表明，TSQs以浓度依赖的方式影响花青素荧光团的光物理性质，表明其作用模式是基于碰撞的。为了确定是否可以通过将有效的TSQ浓度提高到超过溶解度限制，同时绕过与毒性相关的问题来实现荧光团性能的进一步增强，我们合成了特异性的Cy5-TSQ偶联物，其中我们将COT, NBA或Trolox通过柔性的，12原子连接剂。我们制定了合成此类化合物的一般策略，首先将每个TSQ修饰为包含单个胺官能团，然后将其偶联到市售的双反应性N -羟基琥珀酰亚基酯(NHS)2-Cy5荧光团，以高效率(~ 30-60%)和纯度(>98%)产生单官能团的NHS- cy5 -TSQ物质。
TSQ -共轭Cy5荧光团的整体荧光测量表明，除了荧光量子产率的适度变化外，TSQ -荧光团共轭物的吸收和发射光谱与母体Cy5化合物的吸收和发射光谱在很大程度上无法区分。与Cy5相比，Cy5- cot、Cy5- nba和Cy5- trolox的量子产率分别提高了25%、不变和降低了20%。这种变化可能部分地反映了表观激发态寿命的变化。
为了评估这些荧光团衍生物，我们将每个化合物与胺和生物素功能化的21碱基对双链DNA寡核苷酸反应。利用宽视场全内反射荧光(TIRF)成像，我们在640 nm激光直接照射下，在单分子尺度上评估了表面固定的荧光团- dna复合物的光物理性质。我们使用典型的单分子成像条件和酶促氧清除系统从溶液中去除分子氧，并收集单个分子的荧光轨迹。利用隐马尔可夫模型分析了荧光态和暗态的动力学参数。我们在这里集中在最显著的荧光团光物理参数，平均停留时间在荧光(' on ')状态(τon)。
在60 mW的激光头和~0.2 kW cm−2的成像面上，母体Cy5化合物的平均τ为~4 s。单个痕迹经常表现出短暂的荧光，被暗态驻留打断，这是向三重态偏移的特征。与之前的观察结果一致，在溶液中加入1mm COT、NBA或Trolox，接近溶解度极限时，τon增加了5 - 12倍。
与在溶液中加入毫摩尔浓度的TSQ相比，单个TSQ分子与Cy5的直接偶联大大提高了光稳定性。与大量测量结果一致，每种Cy5-TSQ偶联物的平均荧光强度与母体Cy5化合物相似。然而，值得注意的是，Cy5- cot的荧光强度比Cy5成像时观察到的荧光强度更高(~60%)。我们在照明强度范围内观察到类似的趋势，并且在高10倍的时间分辨率(10 ms)下。这些增强部分解释了母体Cy5荧光团表现出快速闪烁的倾向。计算µ，一个反映光漂白前发射光子数的参数(τon ×平均光子发射率)，表明所测试的Cy5TSQ共轭物是可用的最光稳定的有机荧光基团之一。每个Cy5-TSQ缀合物也显示出单重态氧生成速率的降低，这表明性能的增强是由于三态短途的频率和/或持续时间的减少以及氧化光破坏的可能性的降低。
为了研究观察到的增强是否需要TSQ与Cy5的直接偶联，我们通过与DNA双链中残基的连接将单个TSQ贴在荧光基团的近端。我们合成了COT、NBA和Trolox的nhs反应性衍生物，并将它们与氨基修饰的胸腺嘧啶残基连接在荧光基团附着位点远端两个碱基对上。在每种情况下，近端放置TSQ可增强Cy5的性能。虽然它不如直接连接有效，但TSQ的近端连接对Cy5性能的改善与溶液中1mm TSQ相当或更好。我们通过将Trolox分子移动到距离Cy5附着位点更远的第5和第8个碱基对的位置来检测保护作用的距离依赖性，发现Cy5的增强与空间接近密切相关。
我们使用分子动力学模拟得到Cy5和Trolox在DNA寡核苷酸附着位点的空间分布及其碰撞接触的可能性的粗略估计。在这些分析中，我们考虑了Trolox和Cy5连接策略的灵活性(分别为12原子和14原子连接体)，并发现只有当Trolox连接在DNA双链的2和5位置时，Cy5和Trolox之间才会频繁发生碰撞。我们的研究结果支持基于碰撞的作用模式，并建议通过简单地将一个或多个TSQs放置在靠近荧光团的物理位置上，可以实现有意义的荧光团性能增强。
为了研究Cy5性能的改善是否仅限于脱氧环境，我们在脱氧和氧化条件下对固定化分子进行了体和单分子光漂白研究。每个TSQ与Cy5直接偶联的好处在视觉上是显而易见的。当>90%的亲本Cy5荧光团被光漂白时，>80%的Cy5与TSQ偶联物保持活性。在没有氧清除剂的情况下，更符合细胞环境的条件下，我们观察到，与母体Cy5化合物相比，每种缀合物的光漂白程度都有很大的减少，尽管幅度较小(2至7倍)。单分子数据表明，每种Cy5- tsq缀合物在光漂白前都表现出稳定的荧光。表明在含氧环境中使用共轭物也可以提高灵敏度和信噪比。与缺氧条件相比，Cy5-COT和Cy5-NBA的表现优于Cy5-Trolox。
为了研究在不同的实验条件下，Cy5与TSQ结合是否能有效地减少生物背景下的光漂白，我们对活的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行了单分子荧光成像实验，这些细胞稳定地表达了一个n端snap标记的人多巴胺D2受体10，该受体被Cy5或Cy5COT标记。与体外结果一致，与Cy5相比，Cy5- cot标签的τon显著提高。在成像溶液中加入清除氧成分(3,4-二羟基苯甲酸(PCA)和原儿茶酸3,4脱氧酶(PCD))可显著增强这种效果。相比之下，当我们在相同的脱氧条件下对cy5标记的D2受体成像时，光漂白率的降低伴随着严重的眨眼，这降低了信噪比，并极大地阻碍了对单个分子成像的能力。荧光团性能的改善应该允许在细胞背景下与信号相关的时间尺度上进行强大的单分子跟踪。
提高荧光团稳定性的技术可能对单分子荧光成像特别有利，在这种情况下，高照明强度用于在从毫秒到分钟的时间尺度范围内解析精细信号。现在必须努力研究稳定性增强是否可以扩展到整个视觉光谱和化学上不同的荧光团种类。我们的fluorophoreTSQ偶联物也可用于细胞调查，其中可能需要避免使用溶液TSQ以保持生物完整性或当需要在氧气存在下成像时。直接和近端连锁策略都绕过了目前向高浓度溶液中添加一种或多种化合物的技术所带来的TSQ毒性和溶解度问题。通过增加荧光团的稳定性和亮度，这两种方法也有可能提高荧光成像中的信息含量和信噪比，从而在更长的时间内对过程进行更稳健的跟踪。
我们的发现与基于碰撞的作用机制是一致的，其中荧光团与TSQ之间频繁的直接接触导致三态占用的净减少，从而导致单重态氧产生和光氧化的速度。鉴于目前的文献，令人惊讶的发现是，这样的效果可以通过单个TSQ来实现，这就为不同连接TSQ的组合可以调节荧光团性能的定制增强留下了可能性。这种策略可能特别有利于多色荧光研究，其中不同的荧光团或独特环境中的相同荧光团可能对特定TSQ类型产生优先或消极反应。测试不同荧光团和TSQ组合的努力也可能揭示TSQ作用机制，这将有助于为不同的实验需求设计量身定制的化合物。
参考文献
Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability， Roger B Altman, Daniel S Terry Zhou Zhou, Qinsi Zheng, Peter Geggier, Rachel A Kolster, Yongfang Zhao, Jonathan A Javitch, J David Warren & Scott C Blanchard*，Nat.Methods， doi:10.1038/nmeth.1774
