内容提要
有机小分子荧光团具有化学结构灵活、光学性能可调等特点，在生物传感领域显示出巨大的潜力。然而，经典的有机荧光团基序在激发和发射光谱之间具有很大的重叠，导致需要先进的光学设置来过滤所需的信号，这限制了它们在简单设置场景中的应用。本文开发了一系列具有简单有机基团的波长可调小分子荧光染料(PTs)，其Stokes位移高达262 nm，摩尔消光系数为30,000-100,000 M -1 cm -1，量子产率高达54.8%。此外，这些染料被配制成荧光纳米粒子(PT-NPs)，并应用于横向流动试验(LFA)。因此，SARS-CoV-2核衣壳蛋白的肉眼检测限达到20 fM，与胶体金基LFA的pM检测水平相比，灵敏度提高了100倍。此外，结合环介导等温扩增(LAMP)， LFA系统实现了猴痘单拷贝水平核酸检测的可视化。
PTs染料分子的设计与合成
利用块构建分子工程策略，利用经典的Vilsmeier-Haack (VH)， Wittig和Horner-Wadsworth-Emmons (HWE)反应，很容易组装一系列荧光团(PTs)。我们通过VH反应将醛基引入吩噻嗪或EDOT片段，并通过Wittig/HWE反应构建C=C双键。此外，考虑到基于分子内电荷转移(ICT)的荧光团通常具有较大的Stokes位移，我们在荧光团核心结构中引入了吸电子基团。我们顺利地得到了12种小分子染料，总体收率很好(22%~61%)。从实际应用的角度出发，进行了放大反应，制备了300 mg PT-8和200 mg PT-9，收率分别为48%和35%。该合成路线的简单性有利于PTs的实用性和适用性。我们研究了这12种小分子染料的分子结构与光学性质之间的关系。这些染料的吸收光谱范围为300-600 nm，发射光谱范围为可见至近红外(NIR) I区，范围为450-850 nm。正如预期的那样，所有pt在吸收和发射光谱之间显示出小的重叠，显示出大的Stokes位移(从111 nm到262 nm)。所有PT染料的非标准化UV/Vis光谱分别显示。
PTs染料的光物理性质研究
PT-1、PT-2和PT-3具有相似的吸收/发射光谱，最大吸收波长为385-408 nm，最大发射波长为522 - 527 nm，具有较高的量子产率(43.1% ~54.8%)和亮度(摩尔消光系数与荧光量子产率的乘积)。[ɛ×Φ= 1.8×104 ~2.5×104 M -1 cm -1))(表1)。为了更好地了解PT染料的性质，分别记录了它们在乙酸乙酯、甲苯和二氯甲烷中的光学性质。值得注意的是，PT染料在不同极性和粘度的溶剂中都表现出溶剂变色。在乙酸乙酯、甲苯和二氯甲烷中，PT染料的发射波长相对于DMSO呈现均匀的蓝移。有趣的是，PT-7到PT-12的荧光量子产率在乙酸乙酯和甲苯中增强。波长可调性可通过调节吩噻嗪和EDOT构建块的数量和共轭模的排列来实现。通过引入更多的EDOT或吩噻嗪基团，π共轭作用延长，导致吸收/发射波长(PT-4、PT-5、PT-6、PT-7)发生红移。它们表现出较大的Stokes位移(111 ~ 156 nm)，最大发射波长在600 nm以上。除了共轭体系最大的PT-7外，它们的亮度均为中至高(1.6×104 ~4.5×104 m-1 cm -1)。此外，在荧光团核中引入醛或丙烯酸酯等吸电子基团，构建了给受体模式分子结构(PT-8、PT-9、PT-10、PT-11、PT-12)。值得注意的是，PT-8、PT-9、PT-10和PT-12表现出更大的斯托克斯位移(190-262 nm)，最大发射波长扩展到约700 nm。然而，它们的量子产率和亮度急剧下降，主要归因于吸电子基团诱导的荧光猝灭，这是ICT荧光团长期存在且未解决的问题。
通过平衡亮度和Stokes位移，我们确定了具有一个吩噻嗪和两个非对称结构的EDOT基团的PT-5作为理想的荧光团候选者。PT-5具有最高的摩尔消光系数(97191 M -1 cm -1)、高荧光亮度(4.5×104 M -1 cm -1)和大Stokes位移(156 nm)。此外，在化学结构和光学性质方面具有代表性的PT-5和PT-9表现出令人满意的光稳定性。在化学稳定性方面，我们研究了PT-8携带一个非常不稳定的醛基团，它在强酸或强碱溶液中表现出令人满意的稳定性。
PTs纳米微球的光物理性质研究
具有较大斯托克斯位移的荧光染料亮度相对较低，PT-7、PT-8、pt - 9、PT-10、PT-11和PT-12的亮度较低，主要是由于它们的量子产率较低。另一方面，PT-1、PT-2、PT-3、PT-4、PT-5和PT-6的消光系数较高，量子产率也较好，这得益于它们沿扩展π共轭主链的高度离域电子云。我们相信它们在生物传感方面是非常理想的，并且具有巨大的潜力。为了进一步提高荧光亮度，特别是PT-7、PT-8、PT-9、PT-10、PT-11和PT-12的荧光亮度，人们在提高量子产率方面做了大量的努力，其中最有效的策略是用聚苯乙烯(PS)球包封荧光染料。因此，我们将BODIPY、罗丹明、四苯乙烯(TPE)和所有PTs封装到PS纳米颗粒中。由于PTNPs具有较大的Stokes位移，因此在紫外光下肉眼可以很好地区分PTNPs。
所有PT-NPs的发射光谱显示，PT-9NPs和PT-10-NPs比其他PT-NPs具有更好的荧光强度。染料的荧光性质受到物理状态和化学环境的影响，因此我们选择PT-5、PT-9、PT-10和对照染料(罗丹明、BODIPY、TPE)，测试它们在聚苯乙烯纳米颗粒中的荧光量子产率。PT-5、罗丹明和BODIPY在聚苯乙烯纳米颗粒中的荧光量子产率急剧下降，表明它们遭受了聚集诱导的猝灭。然而，有趣的是，PT-9- nps的量子产率增加到68.9%，与它们在DMSO中的溶解状态相比，显示出14倍的增强，这可能是由于PT-9在PS纳米颗粒中聚集状态下的振动和旋转运动受到限制。此外，这些纳米颗粒的发射光谱存在明显的蓝移。每个荧光纳米颗粒所包裹的染料分子数可达105 ~106个。PT-9的包封率比PT-5低，因为小分子的包封率受其在有机溶剂中的溶解度的影响，而PT-9- nps的荧光量子产率和荧光强度最高。考虑到蛋白质和核酸检测的应用需要高亮度的报告颗粒和经济的染料成本，我们选择PT-9进行生物标志物偶联。通过扫描电子显微镜(SEM)和动态光散射技术(DLS)对纳米颗粒进行了表征，显示出适当的粒径(约300-380 nm)和多分散性。
PT-9纳米微球在检测中的应用
荧光纳米颗粒的亮度增强，保证了体外诊断的敏感性，因此我们转向利用PT-9-NPs快速检测SARS-CoV-2和Mpox。我们选择SARS-CoV-2核衣壳(N)蛋白为靶点，建立SARS-CoV-2 LFA抗原检测系统。SARS-CoV-2的N蛋白是冠状病毒感染过程中高度免疫原性和大量表达的蛋白，通常保守，参与RNA包装和病毒颗粒释放。PT-9-NPs表面通过零长交联剂与小鼠源性抗体(mAbs17)共价修饰。PT-9-NPs@mAbs17预分散在共轭衬垫上。当样品流过偶联垫时，N蛋白与PT-9NPs@mAbs17结合并流向硝化纤维素膜。预嵌在硝化纤维素膜上的mAbs15也能与N蛋白结合，使N蛋白结合的PT-9-NPs@mAbs17在试验系(T线)上被捕获。用固定在质量控制线(C线)上的山羊抗小鼠IgG也能捕获PT-9-NPs@mAbs17。
通过一系列优化实验，该方法在紫外照射下(咽拭子基质中)肉眼检出限可达到1 pg/mL (~20 fM)。当N蛋白浓度增加到10 ng/mL时，由于T和C系争夺PT-9-NPs@mabs17的捕获，C线上的信号减弱。同时绘制扫描曲线。整个n蛋白检测过程耗时10-15分钟。考虑到PT-9在365 nm和450 nm处的吸收强度差异有限(约30%)，加上光谱重叠减少和使用紫外激发的自动荧光，紫外光源足以使该LFA系统具有最佳的检测灵敏度。与市售的胶体金LFA相比，基于pt -9- npslfa的灵敏度提高了两个数量级。300 nm左右的尺寸不影响PT-9-NPs基LFA的条形流动性。随后，为了验证N蛋白检测的特异性，我们还分别检测了SARS-CoV-2的甲型流感、乙型流感和刺突(S)蛋白。结果表明，基于pt -9- nps的LFA系统能够特异性识别N蛋白。值得一提的是，观察时没有使用滤镜，在不遮挡光线的情况下，可以在紫外线照射下拍摄N蛋白特异性测试的照片。采用8例经RT-PCR确认的SARS-CoV-2感染标本和29例经RT-PCR确认为阴性的标本对该方法的临床性能进行评价。基于pt -9- nps的LFA能够拾取所有8个阳性样品，零假阳性，而基于胶体金的LFA只能拾取8个阳性样品中的6个。
LFAs采用罗丹明- nps、BODIPY-NPs、TPE-NPs、PT-9-NPs检测N蛋白抗原。基于PT-9-NPs的LFA和基于TPE-NPs的LFA在紫外照射条件下分别可以通过肉眼可视化检测N蛋白。然而，基于TPE-NPs的LFA只能在200 fM下检测n蛋白(与基于胶体金的LFA相比，灵敏度提高了10倍)。基于BODIPY-NPs的LFA和基于罗丹明- nps的LFA由于Stokes位移较小，其灵敏度无法实现肉眼检测的可视化。
接下来，我们将PT-9-NPs结合环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)将其应用于m痘的核酸检测。LAMP不需要变温装置(保持在65°C)，由于其简单，低成本，高扩增效率和特异性，被认为是传统实时PCR的可靠替代品。我们选择高度保守的m痘基因序列(m- b分泌的m痘tnf - α受体样蛋白基因OPG002)作为检测靶点。然后设计合成了6条LAMP引物，包括2条外引物(F3、B3)， 2条内引物(FIP、BIP)和2条环状引物(LF、LB)。LF和LB分别用荧光素(FAM)和生物素(BIO)标记。兔源抗fam抗体(PT-9-NPs@anti-FAM)标记的PT-9-NPs分布在LFA的偶联垫上。将链霉亲和素(SA)固定在硝化纤维素膜上作为测试(T)线，将抗兔源性IgG包埋在对照(C)线上。进行特异性核酸扩增时，将LB和LF插入LAMP扩增产物中。
值得注意的是，LAMP扩增产物的组成复杂，LAMP扩增子的长度分布在200bp到10000bp之间。在紫外线照射下，肉眼可以看到低至一个拷贝/反应的检出限(LoD)。为了测量在横向流动中可以检测到新型染料的LAMP扩增子的浓度，将LAMP扩增子以102至107倍的梯度稀释。基于PT-9-NPs的LAMP- lfa可以检测稀释105倍的LAMP扩增子。4 pM LB和LF引物)，基于TPE-NPs的LAMPLFA可以检测稀释104倍的LAMP扩增子(约40 pM LB和LF引物)。为了进一步验证该方法的特异性，还对人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、腺病毒三亚型(AdV3)和腺病毒七亚型(AdV7)进行了测试，结果表明该系统对m痘具有高度特异性。
总结
通过构建分子工程策略，设计并合成了一系列小分子荧光团(PTs)，通过π共轭将吩噻嗪部分与EDOT部分合并，具有长Stokes位移(高达262 nm)，大摩尔消光系数(在DMSO中为30,000-100,000 M 1 cm 1)，高量子产率(Φ，在DMSO中高达54.8%)和灵活的波长可调性(从可见光到近红外)。pt的光学性能，加上易于合成和修饰，使其功能潜力得到了广泛的探索和应用，特别是在传染病的快速诊断方面。此外，本研究还利用聚苯乙烯(PS)球制备了荧光纳米粒子(PT- nps)，并应用于lfa。相应的荧光纳米颗粒(PTNPs)表现出高亮度，量子产率提高了14倍。因此，得益于它们的大斯托克斯位移，无需任何复杂的装置、发射过滤器和训练有素的操作人员，就可以实现SARS-CoV-2核衣壳蛋白快速检测的裸眼可视化，灵敏度比胶体金基LFA提高100倍。值得注意的是，与胶体金基LFA相比，该方法能够检出更多经RT-PCR确认的SARSCoV-2感染临床样本。此外，基于PT-9-NPs的LFA检测SARS-CoV-2的灵敏度也超过了报道的使用各种发光材料的LFA。最后，结合环介导的等温扩增对样品进行富集，基于PT-9-NPs的LFA系统实现了m痘单拷贝水平核酸检测的可视化。
参考文献
Organic Fluorophores with Large Stokes Shift for the Visualization of Rapid Protein and Nucleic Acid Assays， Jingkai Yang , Ziyi Xu , Le Yu, Bingyun Wang, Ruibin Hu, Jiahu Tang, Jiahui Lv, Hongjun Xiao, Xuan Tan, Guanghui Wang, Jia-Xin Li, Ying Liu,* Pan-Lin Shao,* and Bo Zhang*， Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202318800.https://doi.org/10.1002/anie.202318800
