内容提要
迫切需要通过防止有害的副作用、癌症复发和转移来改进传统的癌症治疗方法。最近的研究表明，在接受化疗或放疗的组织中，衰老细胞的存在可以用来预测癌症治疗的有效性。为了解决检测工具的缺乏，我们开发了一种生物相容性的、可注射的有机纳米探针(NanoJagg)，它被衰老细胞选择性地吸收并积累在溶酶体中。NanoJagg探针由吲哚菁绿(ICG)二聚体自组装而成，采用可扩展的制造工艺，具有独特的光谱特征，适合于光声断层扫描(PAT)和荧光成像。体外、离体和体内研究均表明，NanoJaggs是一种临床可翻译的衰老检测探针，其PAT信号使其适合用于实体肿瘤化疗或放疗后衰老负荷的纵向监测。
结果与讨论
纳米Jagg探针的合成与表征
在65°C下，将吲吲吲胺绿(ICG)染料水溶液搅拌24小时，制备出纯净的NanoJaggs，然后通过透析和超离心纯化。离心步骤是至关重要的。通过测量j聚集体在lmax = 895 nm处的吸光度和lmax = 780 nm处的ICG来监测NanoJaggs的组装。为了更好地了解离心后得到的颗粒和上清液的结构组成，我们进行了核磁共振和LC-MS/MS分析。在颗粒的色谱图中观察到一个751 m/z的单峰，而上清的色谱图包含多个峰，其中一些已被确定为ICG降解产物。在6.60 ppm处，ICG羰基链中氢对应的1h - nmr峰消失，表明在NanoJagg结构中，两个ICG分子之间形成了桥接键。上清液的1h NMR研究证实了多种化合物的存在，这些化合物占总收率的54%。与先前报道的J聚集体纳米结构不同，NanoJaggs的化学纯度为97%，如HPLC所示。虽然当J聚集体在纳米乳液薄膜中形成时，已经注意到ICG的二聚化，但据我们所知，这是第一个完全由二聚ICG组成的J聚集体纳米颗粒。为了更好地了解获得的纳米Jaggs的尺寸分布和形状，进行了低温电子显微镜(cryo EM)成像，显示了平均直径为34±4.8 nm的半球形NPs。此外，能量色散x射线(EDX)分析表明，硫的存在源于ICG构件上的磺酸基。与ICG相比，NanoJaggs的吸光度光谱显示出红移(λmax = 895 nm， λmax = 780，图1c)，而荧光光谱显示ICG二聚体在聚集体内猝灭(λem = 810 nm)。这种猝灭现象对光声成像是有利的，因为它使吸收的能量转化为声能的比例更高，从而增强了PAT特征。事实上，当归一化到相同的吸光度最大值时，NanoJaggs在总体产生的光声信号中表现出显着的三倍增强。这与之前关于J聚集体光声特性的报道一致。此外，计算出的消光系数为1.92±0.07 × 109 M-1 cm-1，与金属等离子体纳米粒子的消光系数相似，尽管NanoJaggs完全由有机分子组成。当我们将NanoJaggs与ICG二聚体在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中进行比较时，我们观察到二聚体迅速组装成NanoJaggs。这种组合是温度依赖性的，在低温下受到抑制。在不同的生物相关介质(pH为7.4的PBS缓冲液，DMEM, DMEM含10% FBS和仅含FBS)中，在7天的时间内，NanoJaggs的吸光度光谱也没有明显的变化，这表明它们具有显著的胶体稳定性。这些纳米颗粒可以作为冻干粉储存一年以上，或作为水悬浮液储存至少8个月，这大大提高了它们的临床应用潜力。
纳米Jaggs在衰老细胞中的积累
以前的研究表明，ICG染料可以有效地吸收到癌细胞系的溶酶体中。因此，我们假设含有ICG的NanoJaggs可以利用ICG改善溶酶体摄取的益处。与癌细胞和正常(分化)细胞相比，衰老细胞的特征是溶酶体腔室增大，溶酶体体积增大，数量增多。因此，预计会有更多的NanoJagg探针在衰老细胞中积累。为了验证这一假设，我们首先在人肺腺癌(A549)和黑色素瘤(SK-MEL-103)癌细胞系中进行了细胞摄取和共定位研究，证明NanoJaggs与ICG相似，确实靶向溶酶体腔室。接下来，我们想探索纳米Jaggs对衰老细胞的特异性。鉴于衰老是一种异质性反应，取决于触发因素、细胞类型和环境，本研究采用了各种衰老模型。具体来说，化疗药物Palbociclib选择性抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4和6 (CDK4/6)，可诱导SK-MEL-103和A549癌细胞衰老。此外，在A549癌细胞中应用DNA插入化疗药物顺铂，在人WI-38成纤维细胞中应用DNA损伤辐射作为放疗诱导的衰老模型。这些模型的衰老状态通过既定的方案进行评估，包括增加SA-bgal活性，增殖试验和增强p21细胞周期抑制剂的表达。此外，通过Western blotting检测磷酸化视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白表达水平的降低，Rb蛋白是活跃细胞周期进展的标志。一旦成功建立衰老模型，使用共聚焦显微镜对细胞中NanoJaggs的积累进行成像，结果显示，与非衰老细胞模型相比，所有衰老细胞模型中的NanoJaggs都大幅增加，值得注意的是，相对荧光单位是用总细胞面积(µm2)归一化的，以考虑衰老细胞的异常形态和增大的大小，从而确保获得的平均信号在不同细胞类型之间具有可比性。
在衰老的SK-MEL-103和A549细胞中观察到最大的NanoJagg摄取(与非衰老的癌细胞相比，分别为9.4倍和5.2倍)，而辐射诱导的衰老WI-38成纤维细胞的荧光信号仅比相应的未辐照细胞高2.7倍。流式细胞术研究进一步证实了这些结果。虽然已知衰老细胞具有增加的自身荧光，但在NanoJagg的激发和发射范围内，我们没有观察到任何来自自身荧光的干扰。与癌细胞不同，衰老细胞中NanoJaggs的积累是剂量依赖性的，即使在最低的测试浓度(0.4 mg/mL)下也会导致信号水平升高。这与ICG染料形成对比，ICG染料在对照细胞和衰老细胞中均显示出显著的摄取。我们还评估了ICG二聚体的吸收，然而它们快速组装成j聚集体导致了与NanoJaggs相似的吸收模式。共定位研究表明，纳米Jaggs主要积聚在位于核周空间的溶酶体中。而在线粒体或内质网中未观察到明显的积累。此外，采用细胞滴度-蓝(celltir - blue)活性测定法，在大范围NanoJagg浓度(0.1 - 100 μ g/mL)处理的衰老和非衰老人肺腺癌(A549)和黑色素瘤(SK-MEL-103)细胞系中评估NanoJaggs的生物相容性。从补充图S20中可以看出，在这个范围内没有观察到明显的毒性，这证实了NanoJaggs是无毒的，可以安全地用作荧光显微镜检测多种衰老表型的多功能senoprobe。NanoJagg的检测潜力通过另外两种采用非癌细胞系的衰老细胞模型得到验证。Palbociclib处理后，获得了衰老的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，这是一种原代内皮细胞系，而小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)在复制周期的高传代数作为年龄相关的复制衰老模型。传统的SA-b-gal染色和我们的新型NanoJagg染色都是用这些细胞系进行的。palbociclib处理的HUVECs显示SA-b-gal阳性细胞数量增加，并且NanoJaggs的摄取显著增加。在mef中也观察到同样的情况，在复制传代9时，SA-b-gal阳性细胞数量增加，此时也观察到NanoJagg摄取显著增加。这一结果表明，纳米Jaggs除了可以作为化疗和放疗诱导衰老的探针外，还可以用于检测与年龄相关的衰老。
衰老细胞摄取纳米Jagg的机制
在我们观察到纳米Jaggs在各种衰老模型中的积累显著增加后，我们希望对细胞摄取的潜在机制有更多的了解。通常，活跃的内吞作用途径可分为巨胞吞作用(或吞噬作用)、胞吞作用、受体介导的内吞作用(也称为网格蛋白介导的内吞作用)和受体独立的内吞作用(涉及胆固醇结合蛋白小窝蛋白质膜芽)。由于最近的研究已经确定了衰老过程中内吞作用途径的改变，我们开始探索纳米Jagg在细胞前和细胞后摄取抑制剂存在下的摄取。摄取前内吞抑制剂要么阻断基于细胞膜的途径，如巨胞吞作用(phophatidylinostitor -3kinase inhibitor Ly294002)和网格蛋白包被的坑形成(Pitstop 2)，要么抑制参与网格蛋白和小洞蛋白介导的内吞作用的动力蛋白(Dyngo4a)的形成。摄取后抑制剂干扰细胞内的过程，如网格蛋白包被的囊泡从膜分裂的后期(prochlorperazine, PCZ)[56,60]和自噬(Chloroquine)。
使用网格蛋白介导的内吞作用抑制剂(Pitstop 2和Dyngo4a)处理衰老的sk - el -103和A549癌细胞时，观察到NanoJagg摄取显著降低(p < 0.0001)，使用巨噬细胞抑制剂Ly294002观察到的变化较小(p < 0.01)。相比之下，未衰老的对照SK-MEL-103和A549细胞经摄取前内吞抑制剂处理后，细胞内纳米Jaggs的积累没有显著差异，这表明内吞摄取的增加是一种衰老依赖性效应。这与先前的研究一致，这些研究表明，衰老细胞中的内溶酶体机制上调，以及巨噬作用(作为通过营养清除的生存机制)和吞噬作用(作为一种细胞同类相食的形式)的激活。事实上，由于衰老细胞具有吞噬其他细胞和合成物质的能力，衰老细胞经常被与巨噬细胞进行比较。与摄取前内吞抑制剂相反，摄取后抑制剂PCZ和氯喹在衰老和非衰老细胞系中均导致NanoJagg荧光增加。此外，PCZ处理后，与溶酶体的共定位明显降低，这可能是由于PCZ介导的网格蛋白包被囊泡与溶酶体融合的破坏。另一方面，氯喹是一种自噬抑制剂，可诱导溶酶体扩张并影响溶酶体形成下游的各种过程，因此不影响共定位。这些发现表明NanoJaggs通过一种活跃的机制被内化，可能涉及网格蛋白介导的内吞作用和巨噬细胞作用。虽然这一现象之前已经在细胞吞噬的背景下被注意到，它在开发检测策略或改善药物传递方面的应用在很大程度上仍未被探索。考虑到ICG已被观察到与癌细胞膜结合并随后进行内吞作用，我们很容易假设NanoJaggs可能潜在地识别衰老表面体上的特定分子，从而实现选择性靶向。衰老表面体的鉴定代表了一个新兴领域，具有针对衰老细胞的重大潜力，值得进一步研究。未来的研究将进一步深入研究摄取机制，以获得更全面的认识。
利用NanoJaggs评估化疗诱导的异种移植物的体内和体外衰老
为了评估NanoJaggs选择性摄取到衰老细胞的有效性，我们使用了免疫功能低下的小鼠，这些小鼠携带肿瘤异种移植物，这些肿瘤是由SK-MEL-103黑色素瘤细胞建立的，并经过了诱导衰老的化疗。肿瘤形成后，小鼠每天给予Palbociclib治疗7天。这种方案导致高水平的肿瘤间衰老，如SA-b-gal活性增加，增殖标志物Ki-67缺失和磷酸化Rb蛋白水平降低所示。给小鼠单次注射载体(DMEM，不含酚红)、NanoJaggs(200µL, 1 mg/mL)或等量的ICG染料，6 h后通过IVIS荧光成像分析荧光水平。在Palbociclib治疗的衰老肿瘤(n = 4)中检测到显著水平的NanoJaggs荧光，但在对照(增殖)肿瘤(n = 4)中未检测到(p = 0.0077)。相比之下，在非衰老肿瘤(n = 4)中主要观察到ICG荧光(p = 0.0438)，这与先前报道的ICG染料在侵袭性实体肿瘤中积聚的趋势一致。
在对照小鼠中，可忽略的背景荧光信号证实，观察到的荧光主要归因于肿瘤内的NanoJaggs或ICG。此外，随后的离体生物分布研究表明，在给药后6小时，在未治疗和palbociclib治疗的小鼠的网状内皮系统器官(如肝脏和脾脏)中几乎检测不到NanoJaggs荧光。在两组小鼠中，肾脏中都观察到相当大的荧光信号，表明肾脏清除是一种优先的消除途径。
对组织切片进行共聚焦成像，以进一步验证纳米Jaggs在衰老肿瘤中的积累( p = 0.0028)。为了进一步评估NanoJaggs靶向衰老细胞的有效性，我们还利用顺铂处理的A549腺癌细胞建立的肿瘤异种移植物免疫功能低下的小鼠。肿瘤形成后，小鼠接受顺铂腹腔注射或载体注射，每周3次，持续14天。通过SA-b-gal活性的增加和肿瘤生长速率的降低，该方案导致了高水平的肿瘤内衰老。通过尾静脉注射NanoJaggs后，与对照(n=6)相比，顺铂治疗的肿瘤(n=6)的信号背景比显著增加(p<0.05)。此外，nanoJagg给药前后，顺铂处理小鼠的信号与背景荧光比值显著增加(p<0.001)。这种纵向监测清楚地表明，信号的增加完全源于纳米探针在化疗诱导的衰老肿瘤中的积累。
纳米Jaggs在体内衰老细胞负荷光声成像中的造影剂研究
在荧光成像获得令人鼓舞的结果之后，随后进行了一项研究，以探索NanoJaggs作为光声(PA)造影剂的潜力。PA是一种新兴的成像技术，在癌症和其他疾病的转化应用中具有巨大的潜力，因为它增强了成像深度，同时保持了空间和时间分辨率。目前，两种红外(IR)染料ICG和西妥昔单抗- 800cw分别作为PAT药物用于黑色素瘤(NCT05467137)和宫颈癌(NCT03923881)的淋巴结定位临床研究。此外，一些纳米造影剂，包括金属纳米颗粒和有机结构，已经报道并成功地在临床前研究中得到验证。
为了评估NanoJaggs治疗PAT的潜力，我们使用了携带SK-MEL-103黑色素瘤异种移植物的免疫功能低下的雌性裸鼠，将其分为帕博西尼组和载药组。通过尾静脉注射给药NanoJaggs或ICG，注射后间隔6和24小时进行PAT成像(图5a)。通过SA-b-gal活性测定和pRB和Ki-67的免疫组化(IHC)染色，在体内成像后证实了肿瘤内诱导衰老。正如预期的那样，帕博西利治疗组显示溶酶体SA-b-gal活性增加，pRB和Ki-67核染色降低，表明增殖能力降低和衰老程序的实施。此外，用Palbociclib治疗的肿瘤显示出增殖率的显著降低，从而证实了细胞周期停滞特征衰老的开始。
NanoJaggs信号显著分布在palbociclib治疗小鼠的衰老肿瘤中。相比之下，在对照组(未衰老，用载体治疗)增生性肿瘤中，信号集中在肿瘤边缘。信号背景比(SBR)是通过将来自感兴趣肿瘤区域(ROI)的信号除以NanoJagg PAT光谱解混得到的背景信号来确定的。计算对照和palbociclib治疗肿瘤的每个轴向面SBR，在整个肿瘤体积上提供具有代表性的NanoJagg信号。在衰老的palbociclib治疗的肿瘤(n=4)中观察到明显更高的SBR，与增生肿瘤(n=2)相比(p = 0.0135)。通过基于噪声对比比的量化获得的可比值证实了这一观察结果。
PAT成像的优势之一在于它能够获取和分析多个数据流，包括血液氧合和血管共定位等参数，使用来自脱氧(Hb)和氧化(HbO2)血红蛋白的不同信号。对血红蛋白(Hb)、脱氧血红蛋白(HbO2)和NanoJagg/ICG光谱进行线性光谱分解显示，在非衰老肿瘤中，NanoJaggs与Hb和HbO2共定位，表明它们在脉管系统中的分布(图5d)。然而，在palbociclib处理的(衰老)异种移植物中，NanoJaggs被发现浸润到肿瘤组织中，并且与Hb和HbO2信号没有重叠，表明它们没有与脉管系统共定位。为了验证NanoJagg信号的增加不是由于肿瘤内血液灌注的增加，我们在衰老和非衰老肿瘤之间比较了HbO2和Hb信号。该分析显示两组间无显著差异(p = 0.5099和p = 0.2926)。
为了进一步证实NanoJagg信号与衰老相关，我们使用肿瘤大小和生长速度等参数进行了相关性分析。值得注意的是，我们发现光声NanoJagg信号与肿瘤生长抑制率密切相关(r2 = 0.875, p = 0.0061)，而与肿瘤大小无关(r2 = 0.015, p = 0.817, ns)。在内源性血红蛋白HbO2的情况下，没有观察到这种与生长速率的相关性(r 2 = 0.112, p = 0.516, ns)。离体肿瘤切片的荧光成像进一步证实了衰老肿瘤中NanoJaggs的存在。与对照组相比，衰老肿瘤中nanoJagg阳性细胞的总数显著增加(p = 0.0002)。此外，与未处理的对照组相比，衰老肿瘤中的这些阳性细胞显示出显著增加的NanoJagg荧光信号(p = 0.0301)。
最后，PA成像还用于监测NanoJaggs的生物分布和消除途径，证实了离体研究获得的数据。肾脏中强烈的PAT信号表明肾脏清除率与荧光离体和体内数据一致。与离体图像相反，在脾脏和肝脏也可以观察到NanoJagg积聚，可能是由于成像技术的灵敏度提高。然而，重要的是，肝脏、脾脏和肾脏中的NanoJaggs信号会随着时间的推移而降低，并在24小时后显著降低。此外，苏木精和伊红(H&E)染色显示，用纳米Jaggs处理的小鼠和用纳米Jaggs处理的小鼠在组织结构上没有明显的组织学差异，表明肝脏和肾脏没有损伤，脾脏也没有炎症。
总结
本研究中描述的有机纳米结构J-聚集体(NanoJaggs)可以使用一系列技术，如流式细胞术、共聚焦成像、体内荧光和PA成像，在不同的环境下检测各种类型的化疗诱导的衰老，包括体外、体外和体内模型。我们的探针具有高纯度，并且我们已经证明它完全由ICG二聚体组成。纳米Jagg在衰老过程中的优先摄取至少部分受到网格蛋白介导的内吞作用和巨噬细胞作用的调节。NanoJaggs合成简单，对衰老细胞具有特异性，且具有较强的PAT信号，适合大规模制备和临床翻译。NanoJaggs可以有效地作为衰老细胞荧光和PA成像的选择性造影剂。NanoJaggs的特性加上PA成像的增强组织外显率，为将这种传感器探针转化为人类环境提供了一条实用的途径。利用NanoJaggs对衰老负担的体内检测和监测不仅可以对组织功能障碍的程度提供有价值的见解，而且可以极大地影响包括癌症在内的各种疾病患者的风险分层和诊断效率。
参考文献
Indocyanine Green-based Nanoprobe for In Vivo Detection of Cellular Senescence， Andrew G. Baker, Muhamad Hartono, Hui-Ling Ou,Andrea Bistrović Popov, Emma L.Brown, James Joseph, Monika Golinska, Estela González-Gualda, David Macias,Jianfeng Ge, Mary Denholm, Samir Morsli, Chandan Sanghera, Thomas R. Else, Heather F.Greer, Aude Vernet, Sarah E. Bohndiek, Daniel Muñoz-Espín * , Ljiljana Fruk*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202404885.https://doi.org/10.1002/anie.202404885
