内容提要
二区近红外(NIR-II, 1000-1700 nm)光激活有机光热剂，同步实现满足NIR-II荧光成像是非常必要的，但在非辐射衰变的基础上相当具有挑战性。本文采用苯并[c]噻吩基团作为大体积电子给体/π桥，裁剪外围分子转子，巧妙地设计和构建了TPABT-TD。由于其高电子给受体强度和精细调制的分子内运动，TPABT-TD同时表现出在NIR-II区域的超长吸收，在NIR-IIa (1300-1500 nm)区域作为纳米聚集体的强烈荧光发射，以及在1064 nm激光照射下的高光热转换。这些固有的优势使TPABT-TD纳米颗粒具有突出的荧光/光声/光热三模态成像引导的NIR-II光热治疗原位4T1乳腺肿瘤。
结果与讨论
AIE分子设计与光物理性质研究
苯并双噻二唑(BBTD)是D-A-D型结构中极好的组成部分，由于其强的吸电子性，它具有较长的波长。然而，由于缺乏合适的构建模块，许多基于BBTD的分子几乎无法将其最大吸收波长扩展到1000 nm以上。苯并[c]噻吩利用其富电子、较大π共轭长度和较大位阻的突出特性，被深入研究以提供具有AIE特征的NIR-II发光物质。为此，从推荐苯并[c]噻吩作为D/π桥和BBTD作为电子受体开始，进行了微妙的给体工程。设计合成了以N-(4-(己氧基)苯基)-[1,1'-联苯]-4-胺、N-(4-(9hcarbazole -9-yl)苯基)-4-(己氧基)苯胺和N1 -(4(己氧基)苯基)-N4、N4 -二苯基苯-1,4-二胺为分子转子抑制π-π相互作用并作为第二电子给体片段进一步缩小带隙的BPBT-TD、CPBT-TD和TPABT-TD三种分子。由于咔唑基序中氮原子的孤对电子离域，CPBT-TD与BPBT-TD相比，CPBT-TD的色移与咔唑基序中氮原子的孤对电子离域无关。当咔唑被二苯胺取代时，强给电子氮原子导致TPABT-TD红移。相应的，在稀THF溶液中，BPBT-TD、CPBT-TD和tpbt - td的吸收最大值分别在894、890和1010 nm处测出，与能带隙吻合较好(图1C)。发光光谱显示，BPBT-TD、CPBT-TD和TPABT-TD在1000 ~ 1500 nm处具有较宽的发射光谱。TPABT-TD的发射最大值位于1318 nm，使其可以在NIR-IIa区域成像。为了探索聚集状态下的荧光特性，使用不同水分数(fW)的THF/水混合物测量了所得发光原的PL光谱。由于分子间π-π堆积的分布，BPBT-TD和CPBT-TD表现出典型的ACQ属性，随着fW的增加而形成聚集体。对于TPABT-TD，外围安装的二苯胺单元作为主动分子马达，负责其在单分散THF溶液中微弱的荧光，但由于分子内运动的限制，在聚集体中增强发射。
TPABT-TD纳米粒子的光热性质研究
考虑到超长吸收/发射波长，将疏水性TPABT-TD负载到生物相容性DSPEmPEG2000中，形成水分散的TPABT-TD NPs。动态光散射(DLS)描绘了平均直径约为72 nm的TPABT-TD NPs的统一球形形貌。TPABT-TD NPs的超长吸收和发射波长赋予了其进行NIR-II光疗的能力。即使在水中保存7天后，TPABT-TD NPs的大小也略有变化。为了研究TPABT-TD NPs的活性氧(ROS)生成能力，以DCFH-DA为指标。实验组和对照组之间的变化可以忽略不计，这表明TPABT-TD NPs在1064 nm激光照射下无法产生ROS。然后，系统地评估了TPABT-TD NPs的光热发电能力。正如预测的那样，在1064 nm激光照射7 min下，TPABT-TD NPs的温度与NPs浓度和激光功率密度密切相关，表现出可控的光热行为。其中，在1064 nm激光(1.0 W cm−2)的照射下，TPABT-TD NPs(100µM)的温度从21℃迅速上升到58℃(∆T = 37℃)，PCE值高达68.98%。经过五次激光加热/冷却过程后，TPABT-TD NPs仍保持了出色的光热稳定性，确保了PTT过程中连续的热输出。TPABT-TD NPs允许在NIR-II窗口内进行FLI，穿透深度约为1 cm，优于先前报道的NIR-I吸收苯并[c]噻吩基发光剂，在深部成像方面具有很大的前景。为了进一步阐明1064 nm激光比808 nm激光在治疗性能上的优越性，我们对覆盖上述不同鸡胸肌厚度的TPABT-TD NPs和ICG的产热行为进行了评估。如图2I所示，暴露在808 nm激光下的ICG显示，随着鸡胸肌厚度的增加，温度升高的下降更为明显。相比之下，1064 nm激光照射TPABT-TD NPs的温度衰减速率明显较慢，进一步揭示了NIR-II光驱动PTT对深部病变的卓越疗效。
TPABT-TD纳米粒子体外光热治疗研究
受良好的光收集能力和深层组织穿透深度的鼓舞，我们开始评估TPABT-TD NPs对4T1细胞的体外光热治疗能力。即使在100 μM的高浓度下，TPABT-TD NPs也表现出可以忽略不计的暗细胞毒性。TPABT-TD NPs在正常3T3、HUVEC和LO2细胞的治疗中进一步证实了其良好的生物相容性。与此形成鲜明对比的是，在1064 nm (1.0 W cm−2,5 min)的激光照射下，细胞活力随着浓度的增加而明显下降，在100 μM的激光照射下，超过95%的癌细胞被吞噬。为了直观验证TPABT-TD NPs的细胞消融效果，采用双醋酸荧光素(FDA，绿色荧光染色活细胞)和碘化丙啶(PI，红色荧光染色死细胞)进行活/死染色实验。生理盐水、生理盐水+激光(L)和TPABT-TD NPs均可见到全场绿色荧光，而TPABT-TD NPs+L处理组可见到强红色荧光，说明在1064 nm激光照射下，TPABT-TD NPs具有较高的细胞热杀伤效率。此外，利用Annexin V-FITC/PI法流式细胞术进一步阐明了细胞死亡机制。可以明显观察到浓度依赖性的杀瘤作用。在100 μM浓度下，TPABT-TD NPs+L处理组有56.3%的4T1细胞发生坏死，26%的癌细胞处于凋亡状态。然而，在其他三个对照组中，很少比例的细胞出现坏死或凋亡。综上所述，TPABTTD NPs在1064 nm激光照射下具有明显的抗肿瘤作用。
TPABT-TD NPs体内成像和光热治疗研究
由于TPABT-TD NPs在体外具有优越的光疗效果，我们通过静脉注射TPABT-TD NPs到原位4TI肿瘤小鼠体内，研究了体内NIR-II FLI、NIR-II PAI和PTI。在给药后3小时观察到肿瘤部位明显的NIR-II FL和NIR-II PA信号，并在12小时左右达到最大值，表明TPABT-TD NPs具有良好的肿瘤积聚能力，这可以通过肿瘤和主要器官的离体成像进一步验证。随后，评估制备的TPABT-TD NPs在NIR-II多模态成像引导PTT中的疗效。注射后12 h, 1064 nm激光(1.0 W cm−2)连续照射6 min后，肿瘤区域温度迅速升高至62.9℃。生理盐水组肿瘤温度从~37℃略微升高至~42℃。在三模态NIR-II FLI、NIR-II PAI和PTI的帮助下，我们试图证明其光热杀瘤能力。在15天的监测过程中，其他3个阴性对照组的肿瘤大小不断增大。相反，单次注射NPs和单次激光照射可明显抑制肿瘤生长，无复发迹象。肿瘤切片的组织学和免疫组化分析清楚地表明，NIR-II PTT能引起肿瘤细胞的明显异常和对肿瘤组织的实质性破坏。TPABT-TD NPs+L组的H&E和TUNEL免疫荧光染色分析显示，与其他三个对照组相比，TPABT-TD NPs+L组肿瘤区域损伤明显，肿瘤细胞凋亡严重。此外，监测到cd31阳性新形成的微血管和Ki67阳性增殖细胞的显著减少，表明TPABT-TD NPs加激光照射在体内的治疗效果显著。
总结
我们首次报道了一种具有AIE倾向的NIR-II吸收PTA，即TPABT-TD，用于1064nm激光触发的原位4T1乳腺肿瘤的高效光疗。大体积π共轭苯并[c]噻吩作为电子给体/π桥和BBTD单元作为电子受体的推荐共同将其最大吸收/发射峰扩展到NIR-II区。由于AIE的特性，TPABT-TD以纳米聚集体的形式发出明亮的NIR-IIa荧光，从而实现了其他报道的以非辐射衰变为主途径吸收NIR-II的PTA难以实现的高性能NIR-II FLI。TPABT-TD NPs的超高PCE(68.98%)使其对体外4T1细胞具有优异的光热杀伤性能。在三模态NIR-II FLI/NIR-II PAI/PTI的指导下，TPABT-TD NPs可通过精确的1064 nm激光照射获得准确的肿瘤位置和良好的肿瘤消融效果，具有良好的生物相容性。
参考文献
An All-rounder for NIR-II Phototheranostics: Well-Tailored 1064 nm Excitable Molecule for Photothermal Combating Orthotopic Breast Cancer, Dingyuan Yan, Zhijun Zhang,Jianyu Zhang, Xue Li,Qian Wu, Yixiong Gui, Jun Zhu, Miaomiao Kang, Xiaohui Chen, Ben Zhong Tang, and Dong Wang,* Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202401877，https://doi.org/10.1002/anie.202401877
