内容提要
光电可调荧光探针在先进生物成像领域的应用越来越受到人们的关注。光可转换探针可以很好地用于跟踪，而光可转换探针是单分子定位显微镜进行超分辨率成像的关键工具。本文研究了一种具有转换和开关特性的红色和远红色体，即BDP-576和BDP-650。我们的研究表明，这些吡咯基BODIPYs转化为典型的绿色和赎回BODIPYs，完全适应显微镜。我们还表明，这种吡咯基BODIPYs经历了定向光氧化诱导转化，这是我们最近介绍的一种光转化机制，其中吡咯部分起着核心作用。利用这些独特的特征，利用化学靶向部分和Halo标签开发针对不同细胞器或亚细胞单位(质膜、线粒体、细胞核、肌动蛋白、高尔基体等)的靶向光转换探针。BDP-650可以在激光扫描共聚焦显微镜的双色成像中跟踪细胞内囊泡超过20分钟。在单分子水平上研究了这些光转换器的开关特性，然后成功地应用于上皮细胞和神经元的活体单分子定位显微镜。膜和线粒体靶向探针都可以用于在纳米尺度上破译膜三维结构和线粒体动力学。本研究在定向光氧化探针的光转换和光开关特性之间建立了一座桥梁，并展示了该机制在高级实时成像中的多功能性和有效性。
结果与讨论
为了将DPIC机制应用于BODIPY，可以将吡咯偶联到BODIPY上。在α位置显示吡咯部分的吡咯- BODIPYs被描述为红移BODIPY，但它们从未被正式报道为光可转换荧光团。在活体SMLM中使用了Lysotracker red来成像溶酶体，并且在没有任何特定缓冲的情况下，在STORM中也使用了与phalloidin结合的红移吡咯酰- BODIPY,这表明吡咯酰- BODIPY不仅是一种潜在的光转换器，而且可能是一种有效的光转换器。因此，我们假设驱动吡咯- BODIPYs光转化的机制可能是我们最近报道的直接光氧化诱导转化(DPIC)。pyrolyl - BODIPYs (BDP)在激发后达到激发态，通过系间交叉可达到激发态三重态。后一种状态可以使三重态氧(3O2)猝灭，生成活性单线态氧(1O2)。一旦生成，1O2可以在核心BODIPY上反应生成非发射形式，导致光漂白，或者可以在吡咯部分上定向反应生成转换的蓝移发射形式cBDP，导致光转换。转化后，cBDP遵循相同的途径，只是它与1O2的反应只导致光漂白。为了证明我们的假设，我们使用这种吡咯- BODIPY支架来构建靶向探针并研究它们的光转换和光开关特性。
在活体SMLM中使用了Lysotracker red来成像溶酶体，并且在没有任何特定缓冲的情况下，在STORM中也使用了与phalloidin结合的红移吡咯酰- BODIPY,65这表明吡咯酰- BODIPY不仅是一种潜在的光转换器，而且可能是一种有效的光转换器。因此，我们假设驱动吡咯- BODIPYs光转化的机制可能是我们最近报道的直接光氧化诱导转化(DPIC)。pyrolyl - BODIPYs (BDP)在激发后达到激发态，通过系间交叉可达到激发态三重态。后一种状态可以使三重态氧(3O2)猝灭，生成活性单线态氧(1O2)。一旦生成，1O2可以在核心BODIPY上反应生成非发射形式，导致光漂白，或者可以在吡咯部分上定向反应生成转换的蓝移发射形式cBDP，导致光转换。转化后，cBDP遵循相同的途径，只是它与1O2的反应只导致光漂白。为了证明我们的假设，我们使用这种吡咯- BODIPY支架来构建靶向探针并研究它们的光转换和光开关特性。
磷酸体 BODIPYs的合成与光谱性质
为了通过DPIC机制的通用性来展示吡咯基BODIPYs独特的光电转换特性，我们合成了三个探针。反应性n -羟基琥珀酰亚胺酯BODIPYs，即BDP-R6G, BDP-576和BDP-650，与氨基三苯磷盐偶联，以提高其在甲醇中的溶解度，从而在光谱研究中避免聚集现象，2)在细胞光转化研究中靶向线粒体BDP-576-Mito和BDP-650-Mito都是吡咯基BODIPY，在BODIPY的α位置有一个吡咯基团，这是一个有效的芳香单线态氧反应基团(ASORM)BDP-R6G-Mito是作为对照合成的，其中BODIPY的α位置的芳香族部分，一个苯基，不知道对单线态氧有反应。测量了三种基于BODIPY的线粒体探针的光物理性质，并证实添加磷盐不会影响它们的亮度，因为它们显示出高的荧光量子产率。尽管BDP-R6G-Mito是一种黄色发射染料(λabs max = 530 nm)，BDP-576-Mito (λabs max = 576 nm)和BDP-650-Mito (λabs max = 650 nm)完美地适应了560nm典型激发的红色通道和640 nm典型激发的远红通道。
Photoconversion属性
为了评估它们的光转换特性，三个探针被连续波激光连续照射，并随时间记录其发射光谱。与BDP-R6G-Mito表现出较低的光反应性导致缓慢的光漂白不同，pyroyl - BODIPYs的BDP576-Mito和BDP-650-Mito会快速地光转化为新的发光光产物，并在发射上发生次色移。据Freundt等人报道，61 BDP-576-Mito的转化形式，即cBDP576-Mito，与BDP-FL等典型的绿色发光BODIPY具有相似的光物理性质。同样，BDP-650-Mito的转化形式cBDP-650- mito在λex = 506 nm和λem= 515 nm时显示出清晰的光谱和低斯托克斯位移。同样，cBDP-650- mito在λex = 570 nm和λem= 584 nm时显示出清晰的激发和发射光谱，光谱接近于我们合成的与cBDP-650类似的光产物模型苯乙烯-茴香醇BODIPY,67,68和BDP-SA。因此，这些结果表明，辐照后，BODIPY与α位置的吡咯之间的偶联发生破坏。这些光转换器的特性在显微镜中是有利的，因为探针及其光产物都完美地适应了典型的绿色、红色和远红色通道，转换后具有73和76 nm的大次色移，从而限制了成像通道的串扰。
受这些结果的鼓舞，通过确定表1中报告的关键光物理常数，对转换特性进行了深入研究。经辐照后，吡rol - bdp可以发生光转化(表征为光转化的量子产率:ϕPt)，可以是光漂白(表征为光漂白的量子产率:ϕBl)，也可以是光转化(表征为光转化的量子产率:ϕPc)，或者两者兼而有之，以这样的方式:初始形式照射后荧光衰减的指数拟合使我们能够确定光转化的量子产率(ϕPt)。利用发射光产物模型确定了转化的化学产率(η): BDP-FL和BDPSA(合成和光谱)，其中去除了吡咯，用于确定光转化的量子产率(ϕPc)，从而确定光漂白的量子产率(见材料和方法部分)。
正如预期的那样，BDP-R6G-Mito与反应性吡咯基- BODIPYs相比具有较低的光转化量子产率(ϕPt)。有趣的是，尽管BDP-576Mito和BDP-650-Mito具有相似的ϕPt值(~ 3 × 10 - 4 %)，但后者显示出2.3倍的光转换量子产率(ϕPc)，描绘了更快的转化率。因此，根据我们的计算(参见实验部分)，BDP-650-Mito的转化率(η = 28.9±1.3%)优于BDP-576-Mito (η = 7.7±0.4%)。总的来说，与BDP-576Mito相比，BDP-650-Mito表现出更好的光转换性能。虽然pyrolyl - BODIPYs的光转化量子产率(~ 3 × 10−4 %)远低于mKikGR等10−1 ~ 10−2%的光转化蛋白，但它们实际上可能更适合于细胞成像中的光转化。事实上，根据我们在该领域的经验，具有高光转换量子产率的光电可调探针容易产生不希望的光转换，因此难以在生物成像中处理。
基于DPIC机制的转化器的效率取决于其产生单线态氧的能力以及对单线态氧的反应性。因此，确定了BDP-Mito生成1O2 (ϕΔ)的量子产率。再一次，结果表明BDP-576-Mito和BDP-650-Mito具有相似的ϕΔ，这表明BDP-650-Mito更好的光转换性能是由于它对单线态氧的反应性更高，而不是因为它能够产生一些。重要的是，ϕΔ分别为1.4%和1.3%的BDP-576和BDP-650并没有比不可转化的BDP-R6G-Mito产生更多的1O2，这表明吡咯部分没有增加ϕΔ。这一结果很重要，因为它表明，尽管基于DPIC的光转换器需要产生1o2来转换，但它们并不比其他荧光团产生更多的单线态氧，而且它们对它的反应性更强。因此，吡咯醇体吡啶并不一定比其他染料更具有光毒性。事实上，这些ϕΔ≈1%(在甲醇中)甚至低于其他常见的荧光团，如荧光素(在甲醇中为3%，在乙醇中为72%，在文献中为13%)。
重要的是，转换探针必须具有足够的光稳定性，以避免其非转换同源物转换时的光漂白以及转换后的成像过程。因此，转换后的转换形式的光稳定性进行了评估。在我们的条件下(辐照度为532 nm, 66.6 mW·cm−1)，cBDP-650太稳定，无法测定其ϕBl，这表明它具有很高的光稳定性。发现具有2.8±0.8 × 10−5的绿色发射cBDP-576比普通的BODIPY-493 (ϕBl = 2.1±0.5 × 10−3具有更强的光稳定性，并且与不可转化的BDP-R6G-Mito以及转化形式的光转化蛋白一样稳定总的来说，这些结果表明吡咯基BODIPYs具有高效的光转化性能，具有相对良好的转化率和平衡的光转化率以及光稳定的发光产物。结合适应的光谱特性和潜在的高亮度，这些光电转换器似乎适合生物成像应用。
转换机制
虽然吡咯- BODIPY表现出高效的光转化特性，但几个实验表明DPIC机制参与其中。首先，可见光照射后的HPLC质谱分析表明，主要的光产物是氧化([M + O2])的结果。为了证明光氧化在转化过程中的作用，进行了一些实验。首先，将吡咯基BODIPYs暴露于几种活性氧(ROS)中。单线态氧(1O2)和在较小程度上，高浓度使用的羟基自由基(OH•)都被发现可以触发染料基态的转化(图S5和S6)。然后，在DPBF(单线态氧探针)和HPF(羟基自由基探针)存在的情况下，对pyrolyBODIPYs进行辐照，证明BDP576和BDP-650在辐照后都会产生O2和OH•(图S5和S6)。此外，在氘化甲醇中进行转化，其中单线态氧的寿命增加，74并导致随着光转化的量子产率增加而加速转化。最后，我们发现，在已知的n1 O2清除剂三乙胺存在的情况下，辐照显著减缓了转化形式的显现。这些实验表明，pyrolyl - BODIPYs在辐照下产生ROS (1O2和OH•)，单线态氧主要响应它们的转化，这符合DPIC机制总的来说，这些结果重申了DPIC负责观察到的吡咯- BODIPYs的光转化，因为它们与我们之前对香豆素吡咯基光转换器的研究完全一致。
细胞中的光转化
为了扩大吡啶- BODIPY作为光转换器在细胞成像中的应用，BDP576和BDP-650利用选择性靶向部分靶向各种亚细胞结构和细胞器。因此，除了BDP-576-Mito和BDP-650- mito具有靶向线粒体内膜的三苯基磷部分外，BDP576和BDP-650还被转化为质膜(PM)探针。BDP-576- pm和BDP-650- pm使用我们的靶向片段，其效率已经被证明。76−79由于BDP-650与BDP-576相比具有更好的性能，即更高的ϕPc和转化率(η)， BDP-650被选择用于靶向其他亚细胞成分。因此，Phalloidin与BDP-650偶联得到BDP-650- actin, BDP-650- actin靶向肌动蛋白丝，并使用PEG12-Halo标签获得BDP-650- halo，选择性地对遗传编码的halo标记蛋白进行纤维素染色
在使用大单层囊泡作为PM模型检查BDP-576-PM和BDP-650-PM的结合动力学后)，分别使用MemBright和mitotrackackers探针作为参考染色探针，在HeLa细胞上验证了质膜探针和线粒体探针的选择性靶向性。首先，在活细胞中进行bdp -576探针的光转化。使用激光扫描共聚焦显微镜，用BDP-576-Mito标记的细胞可以在初始形式的通道中成像几帧，而不会触发线粒体的不必要的光转换。然后，通过在感兴趣的区域上应用变焦，然后在更高的激光功率下进行几次扫描，并通过监测初始形式通道中信号的减少和转换形式通道中信号的增加，可以很容易地进行单个细胞的光转换。BDP-576-Mito在约30 s内完成光转化，无光毒性迹象。使用BDP-576-PM，在不触发相邻细胞转化的情况下，依次转化HeLa细胞的质膜。此外，BDP-576-Mito和BDP-576-PM在“转换通道”中都显示出6- 8倍的重要荧光增强，这表明线粒体和质膜的光转化效率都很高。
第二次，对靶向BDP-650探针的活细胞光转化进行了评价。由于BDP-650的高亮度，BDP-650- mito和BDP-650- pm提供了强烈和选择性的染色，并且可以在几十秒内转换，在“转换”通道中荧光增强3- 7倍，并具有稳定的转换形式。虽然BDP-650-Actin需要更长的照射时间(80 s)才能达到转化形式的荧光强度平台，但它提供了清晰的肌动蛋白纤维光转化。这种差异可能是由于与BDP-650-Mito和BDP-650-PM的活细胞实验相比，细胞是固定的，或者与膜基线粒体和PM相比，非脂质环境肌动蛋白。在接下来的一系列实验中，BDP-650-Halo通过靶向遗传编码的halo标记蛋白对不同的细胞器进行染色和光转化。在洗涤步骤以消除非特异性结合后，BDP-650-Halo提供了细胞器选择性halo标记蛋白的强烈和选择性染色。对于高尔基体选择性，这是很难确定的，进行了另一个高尔基体驻留酶(NAGT-GFP)的共定位分析。在目标区域照射后，肌动蛋白纤维、细胞核、线粒体、高尔基体和核仁在活细胞中成功光转化。
为了量化显微镜成像过程中的光转换效率，我们测量了不同探针光转换前后的信噪比。令人惊讶的是，质膜和线粒体探针在两个通道中显示出非常相似的信噪比(在20到30之间)。有趣的是，线粒体中的转化使用靶向片段比通过靶向halo标记的蛋白质更有效。BDP-650-Halo获得了最佳的S/N值，特别是当靶向核蛋白和核核蛋白时。这些数据表明，转换后的图像质量高度依赖于转换器的定位。此外，值得注意的是，与“化学”靶向探针相反，BDP-650-Halo的信号强烈依赖于细胞表达蛋白的数量，从而影响S/N。
最后，为了证明我们的转换器在跟踪应用中的实用性，用BDP-650-PM孵育HeLa细胞。PM探针内吞后，获得荧光标记的细胞内囊泡(IVs)。然后在3秒内(由于转换面积小，速度很快)成功地在感兴趣的区域内转换了几个IVs，以获得两组囊泡，可以清楚地区分非转换通道和转换通道。由于BDP650的光转换量子产率(ϕPc = 1.03 × 10- 4 %)及其转换形式cBDP-650的高光稳定性，未转换和转换的单个IVs都可以在21分钟(300帧)内以明确的方式进行跟踪。总的来说，吡咯啉- BODIPY光转换器已经针对各种细胞器和亚细胞区室，并在激光扫描共聚焦显微镜下提供了高效和快速的光转换，并证明了它们在大时空尺度上跟踪亚细胞区室的有效性。
结论
我们能够证明BDP-650可以在没有任何还原性缓冲液或紫外线的生理条件下使用。此外，BDP-650可以在低激光功率下使用，以减少细胞毒性副作用和细胞损伤。引人注目的是，BDP-650具有有趣的特性，允许在不同细胞结构的体积和复杂组织中进行长期成像和薄细节的清晰重建。我们发现pyrolyl - BODIPY可以与Halo-Tag结合以受益于遗传特异性。它还可以结合靶向部分，这使得标记所有原代细胞(神经细胞或免疫细胞，已知难以转染)变得更加容易。使用100%的标记细胞，该策略可以对脆弱的活细胞进行更强的统计。最重要的是，它适合高空间分辨率，这完全适合STORM成像。尽管BDP-650跨越了STORM成像中广泛使用的两个成像通道(561和640 nm)，但在PALM采集过程中，它仍然可以与PA-GFP形式一起使用。最后，BDP-650的特性为活细胞STORM成像开辟了一个新的领域。事实上，在接下来的几年里，在近红外通道(通常使用730nm激光线)中开发可激发的原生形式的BDP将是有趣的。因此，我们认为具有改进性能的新一代BODIPYs将实现3D活细胞和多色STORM成像。
参考文献
Targeted Photoconvertible BODIPYs Based on Directed Photooxidation-Induced Conversion for Applications in Photoconversion and Live Super-Resolution Imaging， Lazare Saladin,# Victor Breton,# Valentine Le Berruyer, Paul Nazac, Thiebault Lequeu, Pascal Didier, Lydia Danglot,* and Mayeul Collot*,J. Am. Chem. Soc. https://doi.org/10.1021/jacs.4c05231
