内容提要
半导体聚合物(SPs)作为近红外(NIR-II)荧光成像导航光热治疗的候选材料具有很强的光捕获能力和灵活的可调性，具有很大的可行性。然而，传统SPs的荧光信号由于π-π的强堆叠而在聚集态中猝灭，从而导致辐射衰减途径关闭。为了解决这一问题，聚集诱导发射效应被作为一种合理的策略来提高NIR-II发射体的聚集态荧光。在这项贡献中，我们开发了一种基于嵌段共聚的精确分子工程策略，将平面和扭曲段整合到一个共轭聚合物主链中，为调整SPs的光物理性质和光热转换能力提供了很大的灵活性。通过三元共聚的方法，将两种分别具有扭曲和平面结构的单体巧妙地结合在一起，产生了一系列新的SPs。最优共聚物(SP2)在保持典型聚集诱导发射特性的前提下，同时表现出良好的吸收能力和NIRII量子产率，使NIR-II荧光亮度和光热性能达到平衡。由最佳SP2制备的水分散纳米颗粒在体外和体内均显示出有效的光热治疗效果。体内实验表明，SP2纳米颗粒具有优异的NIR-II荧光成像性能和对肿瘤的光热消融，具有突出的肿瘤蓄积能力和良好的生物相容性。
结果与讨论
聚合物设计原理及理论计算
为了构建NIR-II荧光团，我们设计了典型的强电子D-A型组成的SPs，使最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)之间的电子云高度分离，从而导致窄带隙和波长红移增强。与广泛使用的三苯胺给体核相比，含有sp3杂化硫原子和氮原子的吩噻嗪(PTZ)具有优越的给电子能力和优良的非平面船形构型。因此，在聚合物结构中引入PTZ单元有利于阻碍π-π堆积聚集和准分子的形成，从而有助于增强共轭聚合物的聚集态荧光。因此，我们在聚合物骨架中使用PTZ衍生物作为给体单元来提高NIR-II的荧光效率。同时，利用吸电子能力强的苯并[1,2-c:4,5-c ']双([1,2,5]噻二唑)(BBTD)作为接受电子段拉低LUMO能级。此外，在BBTD核附近加入噻吩作为供体/π共轭单元，进一步促进分子内电荷转移过程，减小重复单元的能带隙。此外，为了提高SPs的溶解度，调节构型，微调SPs的光物理性质，我们巧妙地控制了噻吩部分上烷基链的位置。例如，由于烷基侧链与BBTD单元之间固有的空间距离，位于噻吩位的烷基可能形成共面T-BBTD-T模块，而邻位的烷基链可能对BBTD核心产生较大的空间位阻，从而获得扭曲的主链结构。
SPs的合成及其光物理性质
单体PTZ按照图所示的程序合成，另外2个含bbtd的单体可在市售。单体PTZ与T1-BBTD-T1(扭曲单体)或T2-BBTD-T2(平面单体)的Stille缩聚分别生成共聚物SP1和SP5，而单体PTZ、T1-BBTD-T1和T2BBTD-T2的随机缩聚生成三元嵌段共聚物SP2 ~ SP4。通过精确地改变这3种单体的进料摩尔比，所得到的共聚物的光物理性质有望相应地调整。由于邻位烷基取代基与BBTD段之间的位阻作用，SP1的THF溶液的最大吸收波长(λabs, max)为712 nm，而SP5的λabs, max由于其较高的π共轭程度，在THF溶液中明显红移了~110 nm。SP2 ~ SP4的λabs和max分别位于746、778和816 nm。另外，在808 nm激光光源SP1到SP5的平均摩尔消光系数分别为0.69 × 104、1.09 × 104、1.37 × 104、1.68 × 104和2.03 × 104 M−1·cm−1。这些结果与上述理论计算一致，进一步验证了共面部分对吸收波长和光收集能力的积极影响。更重要的是，这些聚合物的光致发光(PL)光谱覆盖了NIR-II窗口，SP1至SP5的最大PL峰分别位于988、1,015、1,021、1,091和982 nm，其肩峰延伸超过1,250 nm。此外，还研究了这些SPs在聚集体状态下的PL性质。随着THF/水混合物中水含量的增加，SP1和SP2的PL强度显著增强，表现出典型的AIE行为。这种现象可能是由于扭曲段T1-BBTD-T1相对较高的组成导致聚合物结构相对扭曲。然而，在水分数为90%时，SP3至SP5的发光强度分别仅为THF溶液中发光强度的80%、22%和24%。SP3到SP5的聚集态PL性能下降可能是由于大部分π共轭共面T2-BBTD-T2段的比例增加，这有利于形成有害的链内和/或链间π -π相互作用，从而以密集的包装方式淬灭荧光信号。这些结果清楚地证明了三元共聚策略的有效性，通过微妙地调节扭曲段和平面段的摩尔比来精确调节NIR-II SPs的吸收行为和AIE特性。
SP NPs的光物理性质和光热性能
为了使疏水聚合物具有优异的水分散性和扩展的血液循环能力，用于生物治疗，我们利用两亲共聚物2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000 (DSPE-mPEG2000)作为包封基质，通过纳米沉淀工艺将SP1到SP5组装成NPs。接下来，研究了SP1至SP5的光物理性质。SP1至SP5 NPs的λabs、max分别位于741、774、818、838和856 nm处，相对于对应的THF溶液具有更长的吸收波长，同时随着平面T2-BBTD-T2段组成比例的增加呈现逐渐的红移趋势。SP1至SP5 NPs的PL光谱都覆盖了NIR-II窗口，且明显的尾部延伸至1,300 nm，表明它们在体内潜在的NIR-II FLI是可行的。在IR-26探针(QY = 0.5%，二氯乙烷)808 nm照射下，计算出NIR-II窗口SP1至SP5 NPs的QY值分别为0.87%、0.30%、0.20%、0.12%和0.16%。这些结果表明T2-BBTD-T2节段扭曲的主干极大地促进了QY值。然后，评估这些NPs的NIR-II成像能力。如图4D所示，SP1和SP2 NPs在3种不同的长通(LP)滤波器下均表现出较强的荧光信号，在NIR-II FLI中表现出优势，而SP3至SP5 NPs的成像亮度略有遮蔽。随后，在808 nm激光照射下，估计了所得NPs在水溶液中的光热转换能力。在0.8 W/cm2的功率密度下连续照射5min后，SP2 ~ SP4 NPs的温度均达到65℃以上，而SP1 NPs的光热转换能力略差，可能是由于其在808 nm处的吸收能力相对较弱。对于SP5 NPs，大π共轭平面的T2-BBTD-T2单元可能会增强NPs中SP5的链内和/或链间相互作用，从而部分地刚性结构构象，抑制主链扭转运动。相比之下，平面化和扭曲结合成一个聚合物可能导致更松散的堆叠模式，有利于链内和链间的运动，从而有利于NPs内的热量产生。上述结果表明，NIR-II FLI和光热性能的平衡调节和巧妙整合可以通过微妙的调节扭曲和平面T-BBTD-T片段的摩尔比来实现，这表明NIR-II FLI辅助光热治疗的分子工程策略可能是有效的。
体外肿瘤杀灭研究
受SP2 NPs良好的光物理性质和光热性能的启发，我们下一步研究了SP2 NPs对小鼠肝癌4T1细胞的体外协同光疗效果。为了从视觉上评估体外PTT效率，采用双醋酸荧光素/碘化丙啶进行双染色，在共聚焦激光扫描显微镜下区分活细胞(绿色荧光)和死细胞(红色荧光)。如图5A所示，PBS、PBS +激光和SP2 NPs组均检测到较强的绿色荧光，表明所利用的激光功率不良反应最小，SP2 NPs具有良好的生物安全性。值得注意的是，使用SP2 NPs与激光结合的组完全被红色荧光染色，表明SP2 NPs对4T1细胞具有良好的PTT性能和显著的可控性。此外，定量评估了SP2 NPs对4T1细胞的剂量依赖性肿瘤杀伤特性。在没有激光照射的情况下，即使在SP2 NPs浓度为50 μg/ml的情况下，SP2 NPs对细胞活力的影响也不大。然而，808 nm激光激发7 min后，细胞存活率随着SP2 NPs剂量的增加而下降。此外，采用CCK-8法评价SP2 NPs对正常RAW 264.7细胞的生物相容性。图5C的结果显示，SP2 NPs (100 μg/ml)在暗处孵育24小时后，仍有90%以上的RAW 264.7细胞存活，表明SP2 NPs对正常细胞的细胞毒性可以忽略不计。这些体外实验结果证明了SP2 NPs在PTT高效杀瘤应用中的可行性。
体内成像和光热抗肿瘤性能
开发多功能光疗技术的根本目的是实现肿瘤的精确诊断和提高体内的杀瘤效果。在对SP2 NPs进行体内NIR-II fli导航PTT评估之前，我们使用不同的LP过滤器在水溶液中不同浓度的SP2 NPs下验证了它们的NIR-II成像能力。显示了明显的剂量依赖性NIR-II信号，表明SP2 NPs在体内NIR-II成像中应用的可行性。接下来，通过覆盖样品上方的鸡胸组织来估计SP2 NPs的NIR-II荧光的穿透深度。即使在鸡组织厚度为5 mm时，SP2 NPs的NIR-II荧光也可见，显示了NIR-II光的深穿透优势。随后，为了进一步评估SP2 NPs在体内的肿瘤NIR-II FLI能力，我们在808 nm激光激发下用1064 nm LP滤光片尾部静脉注射SP2 NPs后，捕捉了4t1荷瘤小鼠的NIR-II荧光图像。小鼠在SP2 NPs处理前(0 h)呈现极微弱的自身荧光，表明本底干扰较低。注射SP2 NPs 3 h后，在肿瘤区域内捕捉到NIR-II荧光信号升高。提示SP2 NPs在肿瘤切片中良好的积累可能与增强的渗透性和滞留效应有关。
随着时间的延长，肿瘤切片上定量的NIR-II荧光亮度不断增强，在注射12 h后达到最大值。随着时间的延长，NIR-II荧光信号由于NPs的代谢而降低。为了评估SP2 NPs的PTT电位，我们在808 nm激光源激励下对4t1荷瘤小鼠皮下进行了体内光热评价。尾静脉给药12 h后，用808 nm激光连续照射肿瘤区域6 min。SP2 NPs治疗后，肿瘤区域在6 min内温度从36℃显著升高至51℃，说明SP2 NPs在肿瘤内光热转化效率高，光热杀瘤潜力大。相比之下，pbs注射组仅观察到4.0°C的轻微温度升高。这些结果证明，由于激发光的精确可控性，SP2 NPs可以有效地在肿瘤区域积累并具有照射位点特异性光热消融。此外，通过这种智能光疗平台，有望防止正常器官/细胞的热损伤，这比传统的化疗和放疗具有显著的优越性。基于SP2 NPs显著的NIR-II FLI能力和高效的体内产热能力，在808 nm光照下，采用4t1荷瘤小鼠皮下实验研究SP2 NPs在体内的PTT能力。将4t1荷瘤小鼠随机分为4组，分别为“PBS”组、“PBS +激光”组、“SP2 NPs”组和“SP2 NPs +激光”组。“PBS”组、“PBS +激光”组和“SP2 NP”组肿瘤生长呈稳定上升趋势，说明激光照射或单独注射SP2 NP对肿瘤生长几乎没有抑制作用。与之形成鲜明对比的是，“SP2 NPs +激光”组明显抑制了肿瘤的生长，显示出出色的PTT杀瘤效率。在整个治疗期间，没有观察到治疗引起的体重变化和小鼠死亡，这表明SP2 NPs的不良影响可以忽略不计。这与体外实验证明SP2 NPs具有良好的细胞相容性是一致的。接下来，对肿瘤组织进行组织学和免疫组织化学分析，进一步评估PTT的效率。“SP2 NPs +激光”组肿瘤组织的苏木精和伊红(H&E)染色显示肿瘤细胞严重坏死，肿瘤细胞明显异常，可见大量空泡和明显的核固缩。对照组肿瘤组织损伤小，肿瘤细胞分布广泛，排列致密。同样的结果也可以从Ki-67免疫荧光染色分析中得出，在SP2 NPs和激光处理下，很少观察到增殖的肿瘤细胞。以上结果均表明SP2 NPs在NIR-II fli引导的PTT以及肿瘤的实时监测和治疗效果方面具有良好的应用前景。
结论
在本实验中，开发了一种精确的工程策略，将平面化和扭曲结合成一个共轭聚合物主链，允许灵活调整SPs的光物理性质和光热转换能力。采用三元共聚的方法，将具有邻位烷基单元的扭转单体T1-BBTD-T1和具有间位烷基单元的共面单体T2-BBTD-T2巧妙地结合在一起，制备了SPs。通过精心调节T1-BBTD-T1和T2-BBTD-T2单体的投料比，获得了具有适当扭段和平面段组成的最佳共聚物SP2，该共聚物同时具有AIE特性，在808 nm处具有较高的吸光度(1.09 × 104 M−1·cm−1)，NIR-II QY(0.3%)令人满意。该共聚物具有平衡的NIR-II荧光输出和光热行为，其相应的水分散NPs用于治疗应用，表现出突出的NIR-II FLI效率和对肿瘤的光热消融能力，并具有良好的生物相容性。本工作不仅为NIR-II光疗提供了一个有效的SP系统，而且突出了智能和合理的分子工程策略，以实现单一剂中NIR-II荧光亮度和光热性能之间的最佳平衡。
参考文献
Precise Planar-Twisted Molecular Engineering to Construct Semiconducting Polymers with Balanced Absorption and Quantum Yield for Efficient Phototheranostics ，Xiang Su , Zhirong Bao, Wei Xie , Deliang Wang , Ting Han* , Dong Wang* , and Ben Zhong Tang* ,Research 2023;6:Article 0194. https://doi.org/10.34133/research.0194
