内容提要
我们提出了一种新的NIR-II支架，具有刚性共轭中间体，旨在实现高QYs。此外，该设计还结合了染料中供体和受体之间的分子内电荷转移(ICT)，以实现大量的斯托克斯位移，以及大量替代以抵消ACQ行为。为了验证所提出的概念，我们战略性地设计并合成了一系列新的基于二苯并氟(DBF)的NIR-IIa荧光团，这些荧光团由四种类型的电子给电子基团终止:三苯胺、二乙基苯胺、julolidine和四甲基julolidine，分别生成DBF- t、DBF- n、DBF- j和DBF- bj。DBF中间体具有刚性和高共轭核，中心有一个带正电的氧原子。为了与传统的多甲基中间体进行全面比较，我们还设计合成了不对称和对称的NIR-IIa多甲基NIR1330、NIR1335和NIR1325。对这两个核心进行系统比较，然后将DBF-BJ应用于体内高对比度NIR-IIa血管成像，并结合3D血管增强算法获得高分辨率3D图像。
结果与讨论
新型高荧光量子产率窄带隙dbf基分子的合理设计
概述了本研究目标分子的合成路线，其中化合物3的前体二苯并氟烷核心是在酸性条件下通过1,6二羟基萘和邻苯二酸酐缩合合成的。二苯并氟烷/萘荧光素衍生物在可见光区发光染料的合成中得到了广泛的研究，最近的进展使其向≈674 nm的更长的发光方向发展。在这里，我们打算拉长其p共轭核，并在其末端加入强给电子基团，目的是使发射波长> 1300nm红移。因此，用n -苯基-二(三氟甲烷磺酰胺)将二苯并氟烷核心的3,11位转化为二三氟酸盐，然后用钌催化的四丁基溴化铵取代得到化合物3。我们知道电负性氮是设计供电子发色团的理想选择，我们首先用Vilsmeier试剂引入醛，然后通过Wittig反应生成烯烃，合成了化合物5、6、8和12。为了将这些给电子基团与二苯并氟烷核心偶联，我们采用Heck反应与Pd(II)催化剂进行C-C偶联。[11]得到的闭环内酯化合物13a-d在NIR-II区无荧光。通过与乙醇酯化打开环，形成NIR-II发射化合物DBF-T、DBF-N、DBF-J和DBF-BJ，呈阳离子构型。为了与柔性二烯中间体组成的多甲基进行比较，我们合成了三种NIRIIa发光多甲基，包括不对称NIR1330和对称NIR1335/NIR1325。合成了对称和不对称多甲基NIR1325、NIR1335和NIR1330。具有NIR-IIa发射的对称多甲基已被Fan的团队先前报道过，而对称多甲基向不对称多甲基的扩展最近引起了相当大的关注，因为它们具有特殊的光学性质，尽管它们的发射仍然被限制在≈1100 nm。在这里，我们合成了具有5元和7元菁桥的五甲基和七甲基支架的对称多甲基，其中环化硫代吡啶化合物18通过Knoevenagel缩合偶联在两个末端，得到NIR1325和NIR1335。为合成不对称类似物，将化合物23一端与黄原-9-基苯甲酸化合物20选择性缩合，另一端与环化硫代吡啶化合物18选择性缩合，得到不对称聚甲基NIR1330。与DBF系列类似，所有的多甲基也带正电荷，由四氟硼酸盐阴离子平衡。
DBF和聚甲基染料的光物理性质
首先研究了CH2Cl2中dbf和多甲基的详细光物理性质，DBF前体的闭环内酯只在可见光区吸收和发射，而开环的酯化产物则明显红移到近红外/NIR- ii区。吸收最大值在784 ~ 930 nm之间，发射最大值在1230 ~ 1305 nm之间。在这些DBF衍生物中，DBF- t具有最短的吸收和发射波长，分别位于784和1230 nm。蓝移特性可归因于三苯胺在有机溶剂中的聚集诱导发射(AIE)特性，本研究进一步证实了这一点(。用二乙基苯胺取代三苯胺，即DBF-N，吸收峰和发射峰分别轻微红移至834 nm和1235 nm。有趣的是，DBF-J在920 nm和1305 nm处分别显示出明显的吸收和发射红移。这种明显的红移可以归因于末端julolidine部分的受限旋转自由，这改变了电子环境并影响了分子的能级。为了在平面julolidine上施加空间位阻以实现抗ACQ功能化，在两侧的julolidine单元上放置四甲基外设，生成DBF-BJ。DBF-BJ和DBFJ的吸收>900 nm, NIR-IIa的发射波长分别为1300 nm和1305 nm。值得注意的是，这些DBF系列显示了370到446nm之间异常大的Stokes位移，表明在供体-受体框架内涉及显著的ICT效应。据我们所知，这是有机染料的第一个例子，其排放量>1300 nm，非凡的斯托克斯位移>370 nm。此外，随着溶剂极性的增加，明显的色移荧光峰进一步支持ICT效应。
然后，我们以IR-1061(在CH2Cl2中QY = 1.7%)为参考，确定了所研究发射体的相对QY, DBF系列、DBF- t、DBF- n、DBF- j和DBF- bj的QY在CH2Cl2中分别为0.116%、0.377%、0.136%和0.090%。另一方面，NIR-IIa对称型和非对称型多甲基化合物NIR1325、NIR1330和NIR1335的Stokes位移发射都非常小，约为45 nm，在极性溶剂中，其色移发射极小，表明其内部重组能相当小。值得注意的是，DBF系列的QY比所有已研究的QY范围为0.005-0.010%的聚甲基或已报道的NIR-IIa对称的QY范围为0.009-0.015%的聚甲基至少高出一个数量级。此外，DBF系列具有极高的摩尔吸收率，再加上其高QYs，使得其荧光亮度比多甲基高出约25-241倍，被认为是所有报道的NIRIIa荧光团中最亮的，最大发射值> 1300nm。
Pdots的制备与表征
为了进一步阐明聚集的影响，DBF染料、DBFT、DBF- n、DBF- j和DBF- bj被制备成半导体聚合物点(Pdots)，其中采用体积较大的半导体聚合物Pttc-TTQ作为聚合物基质包封DBF染料。据报道，Pttc-TTQ是一种有效的抗ACQ聚合物，可以将Pdots中的发射QY提高数倍。接下来，我们评估了DBF纳米颗粒在水介质中的光物理性质。DBF-T Pdots在水介质中发出强烈荧光，在1008 nm处具有聚集诱导的蓝移发射峰。尽管其高QY(0.736%)，但较低的摩尔吸收率(800 M−1 cm−1)降低了所得DBF-T Pdots的亮度。另一方面，DBF-J的发射时间较长，峰值在1230 nm处，显著促进了对生物组织的深入渗透。然而，在含水介质中极低的QY(0.004%)阻碍了其在生物成像中的进一步应用。通过在DBF-J的julolidine单元上修饰四甲基，DBF-BJ Pdots的荧光强度提高了4.5倍，在水中的发射QY达到0.018%。这很有趣，因为只要在外围基团上简单地添加四甲基取代，而不改变整个DBF框架，抗ACQ特性似乎就能很好地发挥作用。因此，DBF- bj的高摩尔吸收率(10 300 M−1 cm−1)，超过1200 nm的发射波长，以及378 nm的大量Stokes位移使DBF- bj成为DBF系列中最有希望应用NIR-II成像的候选者。
为了进一步比较DBF-BJ Pdots与Pdot形式的NIR-IIa聚甲基Pdots的光物理性质，我们使用相同的纳米沉淀法制备了基于聚甲基的Pdots。列出了光谱特性的系统比较。对称多甲基化合物NIR1325和NIR1335分别在1290 nm和1300 nm处表现出发射峰，在Pdot形式下，QY分别为0.0009和0.0008%。而非对称多甲基NIR1330 Pdots的发射波长为1295 nm, QY为0.001%。所有的多甲基在聚集态(例如Pdot形式)都会遇到严重的ACQ问题，这主要是由于它们非常小的Stokes位移(15 - 20nm)和/或柔性中间体有利于其堆叠。因此，聚甲基Pdots仅表现出适度的荧光亮度，比DBF-BJ Pdots低约10-15倍。
DBF与聚甲基的亮度比较
在体内生物成像之前，我们首先使用MTT法评估了Pdots的体外细胞毒性。我们以DBF-BJ Pdots为例，MTT试验结果表明Pdots具有良好的生物相容性。然后，我们对小鼠进行了体内全身血管成像，以比较四种Pdots, DBFBJ, NIR1325, NIR1330和NIR1335 Pdots。精心控制Pdots的粒径在100 nm以下，这是一个有利于静脉注射的尺寸。与NIR1325、NIR1330和NIR1335 Pdots相比，DBF-BJ Pdots在1300 nm甚至1400 nm的NIR-IIa窗口显示出更优越的荧光亮度。使用1300 nm的长通滤光片，可以清晰地看到所有使用的Pdots活体小鼠的全身血管结构。不同Pdots的成像分辨率差异不明显。然而，当切换到1400 nm的长通滤波器时，在亮度、信号与背景(SBR)比和空间分辨率方面的鲜明对比清晰可见。这再次证明了DBF-BJ Pdots的亮度优于基于聚亚胺的Pdots。采用1400 nm长通滤波器，测得俯卧位和仰卧位时，血管边缘DBF-BJ Pdots的SBR比分别为2.03和2.37，空间分辨率分别为0.33和0.45 mm。为了更好地理解这一点，用1400 nm LPF测定了nir系列染料的SBR比，并与DBF-BJ进行了比较。NIR1325、NIR1330和NIR1335在血管边缘的SBR值分别为1.42、1.32和1.63，仰卧位时的空间分辨率分别为0.94、1.13和0.94 mm，远远低于DBF-BJ，表明DBF-BJ作为生物成像探针比nir系列染料更有优势。观测结果证实了NIR-IIa或更长的波长成像的好处，可归因于减少的背景噪声。
小鼠体内血液和肿瘤血管的NIR-IIa三维成像
接下来，我们介绍了一种新型的NIR-II三维荧光旋转立体成像系统，该系统集成了一个NIR-II相机和一个360度旋转平台。我们期望重建全面的360度3D图像，特别是专注于血管及其在小鼠中的深度映射。具体来说，这种设置促进了不同的相机视角，从而引入了图像中物体的位置差异。利用这些成对图像的立体匹配，我们可以生成视差图，然后将其重建为深度图。例如，在注射DBF-BJ Pdots后10分钟，使用1400 nm长通滤光片捕获二维荧光成像血管，图像分别从右眼(蓝色)和左眼(绿色)角度获取，旋转3.5°和6°进行NIR-II深度成像。从两个不同的摄像机视点导出的视差图，然后转换为深度图。显示了腹部血管深度图的精确重建(成像深度范围为0 ~−5mm)。该图像描绘了横跨两层的四根主要血管，腹部主要血管以不同的颜色显示，表示不同的深度。值得注意的是，采用具有较大立体基线长度的旋转立体成像可以区分腹部血管的不同层。随后，我们使用这种NIR-II荧光旋转立体成像技术来可视化肿瘤血管网络。MTCQ1肿瘤区域内的血管用不同的颜色描绘，表示不同的深度(范围从0到- 5 mm)。这种可视化提供了小鼠血管网络的清晰和详细的描述。对于3D立体成像，我们在不同的摄像机视角(0°，90°和180°)下获得了小鼠的2D全身血管。旋转小鼠，以不同视角(0°、90°和180°)捕捉二维荧光图像。为了增强图像的清晰度和对比度，我们采用了一种基于Hessian矩阵的血管增强算法。该算法有助于放大血管结构并过滤掉非血管网络。该算法有效地增强了血管结构，同时滤除了非血管网络。随后，我们从得到的视差图中计算深度图，然后重建小鼠全身三维血管系统，在不同视角下可视化。与2D图像相比，3D模型提供了更详细的深入信息，允许精确的位置显示。3D电影可在辅助信息中获得，我们从不同视角(0°- 360°)的一系列2D图像中重建了3D深度图，其中颜色条表示不同深度的位置。总的来说，利用3D NIR-II立体视觉技术，结合NIR-IIa探针DBF-BJ Pdots的高荧光亮度，为先进的3D NIR-IIa荧光成像和进一步的生物工程应用开辟了新的途径。
总结
开发了一种基于DBF的新型分子支架，具有明亮的NIR-IIa发射最大值。DBF系列优异的发射率、>300 nm的大Stokes位移以及对多甲基类似物的优异光稳定性扩大了合成多样性，促进了NIR-IIa区域的发射。将DBF-BJ进一步制备为聚合物点，成功应用于具有深度信息的体内全身血管结构三维立体荧光成像。我们相信这种刚性、坚固性和高度共轭的DBF框架应该适用于进一步开发非多甲基有机排放物，其排放物可以扩展到NIR-IIa甚至NIR-III区域。
参考文献
Ultrabright Dibenzofluoran-Based Polymer Dots with NIR-IIa Emission Maxima and Unusual Large Stokes Shifts for 3D Rotational Stereo Imaging Partha Chowdhury, Zhao-Yu Lu, Shih-Po Su, Meng-Huan Liu, Chun-Yi Lin, Man-Wen Wang, Yi-Chi Luo, Yi-Jang Lee, Huihua Kenny Chiang, and Yang-Hsiang Chan*,Adv. Healthcare Mater. 2024, 2400606, https://doi.org/10.1002/adhm.202400606
