内容提要
单分子定位显微成像（SMLM）通常需要高达kW/cm²的激光照射，以获取足够多的光子用于精确定位。然而，高强度的可见光会对细胞造成严重的毒性，限制其在活细胞中的应用。针对这一挑战，该研究开发了一类新型近红外（NIR）自发闪烁的荧光染料（SMI-NIRs）。这些染料由罗丹明螺内酰胺和半花菁衍生物组成，前者通过pH依赖的螺环化反应在荧光态与暗态之间转换，后者将激发波长移至红外区域。单分子实验表明，这些NIR染料在3.93 kW/cm²的功率密度下，展现出低至0.18%的占空比和高达26,700光子/秒的发射率。光毒性评估表明，721 nm的NIR照明显著降低对活细胞的损伤。该研究将SMI-NIRs应用于活细胞成像，成功实现了线粒体动态变化的超分辨成像，空间分辨率为69.4 nm（傅里叶环相关分析，FRC）。此外，通过SNAP-tag技术对活细胞中的内质网实现特异性标记，超分辨重构出的内质网小管的半高全宽为119 nm。
实验结果与讨论
该研究将罗丹明螺内酰胺和半花菁衍生物结合，开发了一系列SMI-NIRs。SMI-NIR1具有高摩尔吸光系数（83,370 M–1·cm–1）和高荧光量子产率（0.614），其最大吸收和发射波长分别为739 nm和770 nm。pH滴定实验显示，SMI-NIR1的pKa为6.57。此外，SMI-NIR1在连续激发下在PBS（pH 7.4）中的表观光稳定性优于MES（pH 4.7），表明其在生理条件下多数处于非荧光螺环态，适合用于SMLM。基于SMI-NIR1，通过R1和R2处的结构替换而获得SMI-NIR2/3/4。
该研究评估了SMI-NIR1在单分子水平的闪烁特性。通过生物素化的SMI-NIR1-Biotin固定在盖玻片上，在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，以721 nm激光激发，功率密度范围为0.10至3.93 kW/cm²。单分子荧光强度轨迹显示，SMI-NIR1-Biotin在荧光态和暗态之间快速切换，对应于开环形式和闭合螺环形式之间的可逆转变。在3.93 kW/cm2的功率密度下，SMI-NIR1-Biotin的荧光态和暗态平均寿命分别为85 ms和72 s，占空比低至0.18%。
该研究分析了SMI-NIRs结构修改对其单分子闪烁特性的影响，包括SMI-NIR1/2/3/4-Biotin。实验结果显示，尽管增加激发功率密度可以提高亮度，但SMI-NIR2-Biotin和SMI-NIR3-Biotin的占空比分别为1.4%和1.2%，比SMI-NIR1-Biotin的0.18%高。SMI-NIR4-Biotin的量子产率较低，但亮度和收集的光子总数与SMI-NIR1相似。进一步分析显示，SMI-NIR1-Biotin具有最佳的信噪比（32.3 ± 0.2）和定位精度（8.1 ± 0.1 nm）。考虑到其低占空比、高信噪比和精准的定位能力，SMI-NIR1被用于进一步的活细胞SMLM成像。
该研究使用Live/Dead Assay对照射细胞进行了标记，评估721 nm激光对活细胞的光毒性。实验显示，在3.26 kW/cm²的721 nm激光照射下，无论是否使用SMI-NIR1探针，几乎所有细胞都保持存活。相比之下，638 nm激光照射导致细胞膜破裂、细胞器肿胀和结构变形，最终只有68%的细胞存活。这表明，将探针的激发波长向红光区域移动能有效减少光毒性，有利于在活细胞中成像细胞结构和动态过程。
SMI-NIR1能够通过与线粒体内膜的相互作用在线粒体内特异性积累，Pearson相关系数为0.90。在活细胞成像中，该研究优化了激发参数和重建帧数，实现了83.5 nm的FRC分辨率的60秒重建窗口。使用较短的重建窗口和更高功率密度，仍可达到103 nm的FRC分辨率，超过了衍射极限。此外，该研究使用ICG染料标记的荧光微球进行漂移校正，显著提高了图像质量。漂移校正分析显示，x方向平均漂移速度为0.69 nm/s，y方向为1.14 nm/s，定位精度为14.2 nm，FRC分析空间分辨率为69.4 nm。时间延迟SMLM成像揭示了线粒体的融合和裂变过程。
通过酰胺缩合反应，将SMI-NIR1与SNAP-tag配体CLP连接成SMI-NIR1-CLP。在HeLa细胞中，转染了表达SNAP-tag的内质网靶向信号肽（ER-SNAP），并用SMI-NIR1-CLP共孵育。通过SMI-NIR1-CLP与ER-Tracker Green的共定位，验证其有效靶向内质网。定位密度分析显示，SMI-NIR1-CLP在内质网上的密度为1860个定位/μm²，对应的奈奎斯特空间分辨率为46 nm。500帧图像重建显示内质网小管的FWHM为119 nm，远低于261 nm的衍射极限。
结论
这项研究开发了低光毒性的NIR自发闪烁荧光探针，为活细胞SMLM提供了新工具。
参考文献
Near-Infrared Spontaneously Blinking Fluorophores for Live Cell Super-Resolution Imaging with Minimized Phototoxicity. Song Chen, Jing Wang, Daoming Guan, Baojin Tan, Tianli Zhai, Lu Yang, Yuheng Han, Yi Liu, Qian Liu, and Yunxiang Zhang, Anal.Chem. 2024, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c02445
