内容提要
共轭寡电解质(COEs)包括一类具有可调光学性质和脂质双分子层亲和力的荧光报告分子。这些分子已被证明在一系列生物成像应用中是有效的;然而，它们在表征特定亚细胞结构方面的应用仍然受到限制。这样的功能将扩展COE应用程序，以了解细胞功能障碍、细胞通信和不同药物代理的目标。我们公开了一种新的COE衍生物，COE-CN，它可以可视化线粒体，包括形态变化和溶酶体在去极化剂处理后的融合。COE-CN的特点是存在咪唑增溶基团和具有分子内电荷转移特性的光活性氰乙烯基连接的二苯基苯核。相对较短的COE-CN分子长度导致脂质双层膜内的结合较弱，这使得可以对内部细胞结构进行采样，并最终相对于细长的COE进行不同的定位。作为一种实际证明手段，COE-CN可以通过流式细胞术诊断线粒体受损的细胞。再加上在去极化时不易位的细长COE，比例荧光强度的变化可用于监测线粒体膜电位破坏，证明其在诊断分析中的应用潜力。
结果与讨论
合成与表征
合成COE-CN的途径。烷基化苄基氰化物2与二甲氧基对苯二甲酸甲醛之间的Knoevenagel缩合形成了共轭骨架。随后与N,N-二甲基咪唑进行季铵化反应，产率为76%。测定了COE-CN的水溶性> 2mm。详细的合成方法和表征可在辅助信息中找到。通过密度泛函理论计算，COE-CN的总分子长度为3.6 nm，这也揭示了一个相对平面的核心。我们推断，与COE-S6相比，COE-CN的长度减少了102 Å2，总极性表面积(TPSA)增加了55 Å2，这将削弱将COE-CN保持在膜内的疏水相互作用。这些特性预计会降低质膜染色倾向。
光物理性质和脂质双分子层选择性
COE-CN在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中和嵌入由1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱组成的小单层囊泡(SUVs)的脂质双分子层时的相关光学性质在PBS中，COE-CN在392 nm处表现出最大吸收(λabs)，在suv中转移到435 nm。COE-CN在PBS中的发射光谱以525 nm为中心，在脂质双分子层内相互作用时发生蓝移。所得的发射光谱与在甲醇或DMSO中观察到的相似。这些观察结果与分子环境的预期变化一致，反映了从极性较高的水介质到极性较低的脂质双分子层的转变。膜插层也导致荧光强度的增加，可以通过肉眼看到，最终达到35%的量子产率(ΦF)。利用排放强度的增加来估计脂质双层分配系数(Ksuv)，该系数反映了COE-CN对suv的偏好可以看出，COE-CN对脂质双分子层具有较高的偏好(Ksuv = 2.4±0.3 × 106)。Ksuv的这个数量级接近已建立的膜积聚染料所观察到的。
结构对COE亚细胞定位的影响。
我们首先检查了COE-CN的细胞染色模式，以进一步确认我们通过分子设计调节细胞器选择性的策略。5 μM COE-CN染色，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)成像。在较短的15分钟染色时间内，COE-CN的细胞内定位也很明显，在此条件下，COE-S6被观察到染色，因此存在于细胞边界。COE-S6的长时间孵育导致内吞作用和溶酶体膜定位由于与COE- S6的光谱重叠，我们选择了同时具有COE- cn和COE- bo的细胞，COE- bo是一种发红色的COE，同样可以标记溶酶体证实，尽管共孵育不涉及洗涤，但来自两个COE的信号位于相互排斥的亚细胞位置(R = 0.08)。因此，与本文研究的两种细长MICOEs相比，COE-CN的细胞进入率和细胞器选择性的差异表明，它们在质膜内的停留时间更短，这可能是由结构和物理化学性质的差异造成的。我们探索了通常用于评估膜通透性的三个参数，即log P、TPSA和分子长度。方案1中三个COE的这些参数值使用molinspirine进行估计。有趣的是，计算出的COE-CN (- 0.7)， COES6(- 0.38)和COE-BO(- 1.2)的miLogP值均为负，这表明COE-CN具有亲水性行为。与这一观察结果相一致的是，所有分子的水溶解度都是由带电离子群决定的。
尽管COE-CN的高脂质双分子层偏好和亲水性乍一看似乎是矛盾的，但这可以通过定义这些驱动自发膜嵌入的MICOEs的脂质双分子层模拟拓扑结构来调和。因此，其他结构特征在控制COE -脂质关联中发挥同等或更重要的作用。较短的共轭核(COE-CN−3.6 nm, COE-BO−5.2 nm, COE-S6−5.4 nm)和较高的TPSA降低了疏水效应，相对于较长的MICOEs，可能有利于更可逆的脂质结合。55,56此外，与COE-CN相比，COE-S6和COE-BO的阳离子电荷数量较多，可能与膜组分起静电“锁”作用，从而导致膜分离缺乏明显的动态平衡。
线粒体COE-CN染色
为了检查亚细胞定位，我们研究了用COE-CN染色的细胞，并结合染料与已建立的细胞器定位。在30分钟内，观察到与MitoTracker Red(一种已建立的线粒体染色)共定位的细胞的明亮细胞内染色。宽视场图像显示所有细胞染色均匀，没有聚集的COE-CN证据。这些特征有利于荧光显微镜和流式细胞术分析的应用用一组细胞器靶向染料(CellMask Deep Red - Membrane, SYTO Deep Red - Nucleus, LipidTOX Red -脂滴)进行共定位分析，表明COE-CN只内化在线粒体中。最值得注意的是，与以前的质膜标记COE不同，COE-CN不存在于质膜内，如图2c (R = 0.03)。此外，在低至250 nM的浓度范围内实现了有效的线粒体可视化，进一步强调了分子选择性。
通过多次CLSM扫描反复照射染料显示出良好的光稳定性，400次扫描后线粒体仍然清晰可见。此外，所得染料强度与市售染料相当，尽管具有更高的能量激发波长。这种稳定性，再加上在成像浓度下对细胞活力没有观察到的影响，强调了COECN用于长期活细胞成像的潜力。此外，重复图像采集和与染料长时间孵育超过24小时似乎对细胞形态都没有明显的影响。
细胞对COE标签的影响
我们试图确定COE-CN在多大程度上可以用于检查药物治疗条件下的线粒体动力学，这可能会影响染色效率并促进染料向其他细胞器的易位。作为一种典型的去极化剂，羰基氰化物氯苯腙(CCCP)是一种质子离子载体，能在几分钟内使MMP消散因此，我们通过20μM CCCP预处理活细胞，然后添加染料来研究COE-CN染色对MMP的依赖性。与在相同条件下成像的未处理细胞相比，CCCP预处理细胞中COE-CN的荧光强度相对于未处理细胞减弱了约25%，但仍允许线粒体的可视化。其他线粒体特异性染料也观察到类似的结果。我们还研究了细胞固定时的染料保留，这也会减弱MMP，但这是显微镜技术的必要步骤，包括快照特定的动态过程我们对含有COE-CN和Mito Deep Red的固定HeLa细胞进行了成像，已知其在线粒体后固定中持续存在通过结构照明显微镜，可以确定化学固定后COE-CN保留，显示与Mito Deep Red共定位的圆形囊泡结构，对应于线粒体膜定位。因此，足够的COE-CN仍然与线粒体相关，从而能够在不同的处理条件下成像结构变化，否则可能会在整个细胞中重新分配染料总的来说，这些结果表明，在各种条件下(活的、固定的、健康的和去极化的细胞)，COE-CN仍然存在于线粒体内，使其成为细胞成像的通用染料。
Mitophagy成像
我们的下一个目标是通过CCCP处理2小时诱导HeLa细胞的线粒体自噬来证明COE-CN对亚细胞过程可视化的效用，CCCP会触发细胞中受损线粒体的自噬清除，以减轻细胞损伤。细胞最初用标记溶酶体膜的Lamp1-RFP转染，随后用COE-CN染色以观察细胞器相互作用。然后将这些细胞用含有CCCP (20 μM)的培养基或新鲜生长培养基处理2小时。未经处理的细胞在COE-CN照射下显示出具有规则棒状形态的健康线粒体同时，溶酶体呈亮红色囊泡，两种细胞器的空间分布明显，进一步证实了健康细胞中线粒体的专属定位。相比之下，CCCP处理导致线粒体肿胀形成圆形结构这种结构变化伴随着线粒体分裂导致的染色点数量的明显增加绿色斑点与COE标记的线粒体相对应，明显定位于溶酶体囊泡的内部，反映了溶酶体对受损线粒体的吞噬因此，COE-CN可以作为一种有效的荧光探针，用于监测活细胞内线粒体形态和相互作用的变化。
总结
我们设计并合成了一种新的COE衍生物，即COE- CN，它可以在线粒体内快速定位而不停留在质膜上。这种特异性与前几代COEs不同，前者主要通过内吞途径染色质膜或细胞内囊泡，并且独立于靶向基序。COE-CN允许线粒体的选择性可视化，并具有适合实际应用的亮度和光稳定性。此外，在各种细胞染色实验条件下，如去极化或固定，COECN保持足够的亮度，允许处理细胞的成像。因此，COE-CN成功地用于可视化线粒体形态和线粒体自噬时细胞定位的变化。此外，它的膜电位依赖性积累允许使用COE-CN来识别线粒体受损细胞，从而为快速筛选线粒体功能障碍提供了一种新的、简单的、相关的光学报告细胞。COE-CN与治疗后发现不易位的延长MICOE相结合，使线粒体健康评估成为可能。更广泛地说，基于这些发现，我们预计可以开发出新的COE分子设计，作为可靶向的细胞内光学探针，能够报告与疾病识别相关的特定细胞参数。
参考文献
Real-Time Monitoring of Mitochondrial Damage Using Conjugated Oligoelectrolytes，Samuel J. W. Chan, Ji-Yu Zhu, Wilson Wee Mia Soh, and Guillermo C. Bazan*，J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 660−667，https://doi.org/10.1021/jacs.3c10531
