内容提要
吸收波段位于第二近红外(NIR-II, 1000-1700nm)窗口的小型有机光热试剂(PTAs)是有效对抗深部肿瘤的理想选择。然而，很少报道的NIR-II吸收PTA仍然存在摩尔消光系数低，化学稳定性和光稳定性不足以及在治疗过程中所需的高光功率密度的问题。我们开发了一系列二氟化硼二聚体受体集成的小有机PTA。π共轭氮杂环二聚体骨架上的B-N配位键使其具有较强的吸电子能力，有利于形成具有NIR-II吸收的强有力的供体-受体-供体(D-A-D)结构PTA。PTAs即OTTBF具有较高的MEC、超高的化学和光稳定性。在1064 nm光密度低至0.7 W cm-2的照射下，OTTBF NPs包被成水分散的纳米颗粒，可以获得显著的光热转换效果，这是目前已知的用于PTT工艺的最低NIR-II光功率。此外，OTTBF NPs已成功应用于1064nm激光下的体内和体外深部肿瘤治疗。该研究为未来探索用于生物医学应用的多功能D-A-D结构NIR-II吸收有机PTA提供了见解。
结果与讨论
光物理性质的设计与表征
分子内B-N配位键的形成可以增强π共轭骨架的吸电子能力。BODIPY衍生物作为一种突出的二氟硼配合物，在各种材料中得到了广泛的应用。此外，Wakamiya等人最近报道了一种新型的二氟化硼二聚体(BF2BAD)配合物，该配合物在azafulvene单元之间表现出增强的π共轭作用，使其成为构建近红外染料的强吸电子构建块。本研究设计并合成了三种新的PTAs(TPEBF、TPABF和OTTBF)，其中BF2BAD为电子受体，电子给体分别为四苯基乙烯(TPE)、三苯胺(TPA)和烷氧基取代TPA。此外，TPEBF和TPABF中的噻吩作为π共轭介质，同时引入两个烷基链来增强疏水性，减少分子间相互作用。首先，我们比较了808 nm和1064 nm的透光率。激光探测器覆盖不同厚度的鸡胸组织(0、2、4、6、8和10 mm)，然后在808 nm或1064 nm处照射，功率密度分别为0.33、0.7或1 W cm-2。无论激光功率如何，1064 nm激光器的透光率都优于808 nm激光器，更适合深度PTT。TEPBF、TPABF和OTTBF的最大吸收波长分别为714nm (ε = 6.34× 104 M-1 cm-1)、758 nm (ε = 6.73× 104 M-1 cm-1)和892 nm (7.21× 104 M-1 cm-1)。此外，TPEBF和TPABF的吸收波长在1000 nm以上的区域消失，而OTTBF的吸收波长可以扩展到1100 nm，在1064 nm处保持1.68× 104 M-1 cm-1的高ε值，这使得OTTBF在NIR-II窗口中具有较高的捕光能力。同时，三种分子在甲苯中分别在792 nm、880 nm和1058 nm处发出荧光。
然后用生物相容性两亲性聚合物DSPE-PEG2000将疏水分子初始封装成纳米颗粒(NPs)。透射电镜(TEM)分析显示，TPEBF NPs、TPABF NPs和OTTBF NPs呈现一致的球形形貌，直径分别约为93 nm、102 nm和97 nm，小于动态光散射(DLS)结果(133 nm、130 nm和128 nm)。值得注意的是，与TPEBF NPs和TPABF NPs相比，OTTBF NPs在1000-1400 nm的NIR-II窗口范围内表现出更宽的吸收，这表明它是一种有希望在NIR-II区域实现光热抗肿瘤的PTAs。虽然1064nm的生物应用MPE为1W cm-2，但采用较低的激光功率可以提高生物样品的兼容性。在1064 nm处，我们采用0.7 W cm-2的激光功率密度来评估NPs的光热效应。在1064 nm激光(0.70 W cm-2)照射5 min后，OTTBF NPs (50 μg/mL)的温度可达到77.9℃，而TPEBF NPs和TPABF NPs的温度仅略微升高，分别为27.9℃和36.4℃。三种NPs光热效应的差异是由于它们在NIR-II窗口中的吸收能力不同所致。对比了808 nm (0.33 W cm-2时31.5℃，0.70 W cm-2时50.5℃)和1064 nm (0.70 W cm-2时54.8℃)下OTTBF NPs在NIR-II区的光热转换优于NIR-I区的光热转换。为了全面比较深层光热光谱分析NIR-I和NIR-II激光之间的转换能力,最高温度增量的OTTBF NPs记录后由鸡组织不同的厚度,然后辐射到808年或1064 nm的功率密度(0.7 W cm-2) 5分钟。结果表明OTTBF NPs辐照的温度增量1064海里高于808海里,不管被覆盖组织的厚度。此外，OTTBF NPs的温度升高表现出与激光功率密度和NPs浓度相关的行为。TPEBF NPs和TPABF NPs在808 nm (0.33 W cm-2)的辐照下也表现出相似的行为。TPEBF NPs、TPABF NPs和OTTBF NPs的光热转换效率(PCE， η)分别为22.5、37.3和54.1%。通过记录在加热和冷却交替作用下的温度变化，进一步研究了OTTBF NPs的光稳定性。经过五圈后，OTTBF NPs的最高温度变化可以忽略不计。通过检测NPs的吸收强度，研究了NPs的光漂白和抗ROS能力。在808 nm激光(0.33 W cm-2)和1064 nm激光(0.7 W cm-2)的照射下，OTTBF NPs的吸收强度变化可以忽略不计。然而，在相同条件下，吲哚菁绿(ICG)和ICG NPs的吸收强度急剧下降。OTTBF NPs与ICG的对比图如图3n所示。当浓度为200 μM时，次氯酸盐(ClO)、叔丁基过氧自由基(TBO•)、羟基自由基(•OH)等多种活性氧存在时，ICG的吸收强度较原始值下降约95%。然而，在相同的条件下，OTTBF NPs的吸收强度保持不变。与OTTBF NPs相比，TPEBF NPs和TPABF NPs也表现出相对较高的化学和光稳定性。此外，三种NPs在不同pH值的溶液中均表现出较高的稳定性。这些结果证明了BF2BAD受体集成的小型有机PTA的高稳定性和OTTBF NPs出色的光热转换能力，使其非常适合生物PTT应用。
体外实验
受OTTBF NPs出色的光热性能的鼓舞，我们随后在体外评估了其对4T1和MCF-7细胞的PTT效果。首先，采用MTT法研究了OTTBF NPs的暗细胞毒性。不同浓度的OTTBF NPs (0-20 μg/mL)孵育24 h后，细胞活力的下降可以忽略不计，表明其具有良好的生物相容性。然而，在1064 nm (0.70 W cm-2)下暴露7 min时，OTTBF NPs表现出浓度依赖性的光毒性，当20 μg/mL的OTTBF NPs孵育时，细胞活力显著下降至11%。然后比较NIR-I和NIRII窗口下OTTBF NPs的细胞毒性。即使在相同的功率密度下，在所有浓度范围内，1064 nm激光处理组的光毒性也高于808 nm激光处理组。我们还进行了深部癌细胞光热处理实验，验证了NIR-II激活PTT的优势。虽然在不同厚度的96孔板上覆盖OTTBF NPs的光毒性相应降低，但在相同条件下，1064 nm激光处理组的细胞活力仍低于808 nm激光处理组。这与溶液中的结果一致，表明NIR-II区的PTT确实比NIR-I区的PTT更适合于治疗深部癌症。
通过钙黄素AM和碘化丙啶(PI)共染色实验进一步证实了OTTBF NPs的光疗效果，其中绿色和红色荧光信号分别对应于活细胞和死细胞。如图5e所示，PBS和OTTBF NPs组可以观察到明显的绿色荧光信号，表明在这些实验条件下细胞毒性可以忽略不计。而OTTBF NPs +1064 nm组同时显示绿色和红色荧光，且红色信号强于808 nm处理组。将4T1细胞同时用商用溶酶体染料(Lyso-Tracker Green)和Cy5染料负载的OTTBF NPs处理，研究NPs的共定位。LysoTracker的绿色通道与红色通道表现出很强的相关性(重叠系数为0.80)，表明OTTBF NPs通过溶酶体介导的内吞途径内化到4T1细胞。据报道，PDT或PTT可诱导细胞器降解并引发细胞死亡。为了研究OTTBF NPs介导的潜在溶酶体破坏，我们进行了吖啶橙(AO)染色生物成像。通常，AO在完整溶酶体中以质子化低聚体的形式发出红色荧光，而在细胞质和细胞核中以单体去质子化形式发出绿色信号。由于溶酶体完整，PBS和OTTBF NPs组可见鲜红色荧光信号。然而，在0.70 W cm-2的功率密度下，808 nm或1064 nm照射下，AO信号消失，表明溶酶体的完整性被严重破坏。通过AV-FITC/PI染色进一步研究OTTBF NPs光热处理后细胞的死亡途径。光(808 nm或1064 nm)处理后的4T1细胞显示出比PBS和OTTBF NPs组更强的绿色和红色荧光信号，表明处理组细胞凋亡或坏死更多。
NIR-II窗口的体内光热深部组织抗肿瘤治疗
受OTTBF NPs优异的体外光热性能启发，研究了otbf NPs在体内对肿瘤的光子热疗作用。由于OTTBF NPs的荧光强度相对较低，因此将Cy7染料共包被到NPs中。首先，我们在荷瘤小鼠体内通过静脉注射4T1评估了OTTBF NPs在体内的肿瘤积累和生物分布。给药6小时后，在肿瘤部位观察到明显的NIR-II荧光信号，约36小时后信号达到最大强度，表明OTTBF NPs具有显著的肿瘤积累能力。同时，主要器官和肿瘤的离体成像进一步验证了OTTBF NPs在肿瘤中的有效摄取和保留。构建4T1荷瘤BALC/c小鼠，研究NIR-II PTT。将小鼠随机分为4组，处理方式不同:(1)PBS， (2) OTTBF NPs， (3) OTTBF NPs + 808 nm， (4) OTTBF NPs + 1064nm。记录肿瘤的体内光热光谱分析成像红外热成像系统在波长808纳米的激光(0.7 W cm-2)或波长1064纳米的激光(0.7 W cm-2)暴露后静脉管理NPs 36 h。迅速增加在肿瘤部位的温度达到37.0℃到58.6℃在连续激光辐照时间7分钟,这表明OTTBF NPs拥有能够提高肿瘤NIR-I和NIR-II辐照温度。相比之下，仅用激光治疗的对照组的温度变化很小。
监测小鼠肿瘤的绝对体积，评价其体内光热抗肿瘤作用。在NIR-I和NIR-II窗口，OTTBF NPs介导的PTT均取得了显著的肿瘤消除效果，且无复发，说明在激光照射下，OTTBF NPs可以有效抑制肿瘤生长。1064 nm激光处理组的抑制作用略强于808 nm激光处理组。值得注意的是，单独使用PBS或NPs治疗组的肿瘤抑制作用可以忽略不计，在15天的监测期间，他们的肿瘤大小稳定增长。
为了了解潜在的抗肿瘤机制，对不同处理后的苏木精伊红(H&E)和末端脱氧核苷酸转移酶尿苷三磷酸刻痕末端标记(TUNEL)染色进行分析。，OTTBF NPs + 808 nm和OTTBF NPs + 1064 nm处理组的H&E染色观察到严重的肿瘤细胞坏死或凋亡。相比之下，PBS和OTTBF NPs组对癌细胞的损伤最小。两个治疗组的TUNEL分析也显示出明显的病理改变，显示出肿瘤组织的严重损伤。全面考察了OTTBF NPs在PTT过程中的生物相容性。不同处理后荷瘤小鼠的体重无明显变化。关键脏器(心、肝、脾、肺、肾)H&E染色分析未见病理异常及炎性病变。此外，不同治疗组的肝脏(ALT、ALP和AST)和肾脏(BUN和UA)功能标志物没有明显变化，表明OTTBF NPs的肝毒性和肾毒性可以忽略不计。
为了证实NIR-II窗口相对于NIR-I窗口在深部肿瘤PTT中的优越性，我们将鸡胸组织置于4T1肿瘤上，模拟深部肿瘤的周围环境。静脉注射OTTBF NPs后，用5 mm厚的鸡组织覆盖肿瘤，然后分别用808 nm (0.7 W cm-2)和1064 nm (0.7 W cm-2)激光照射肿瘤。1064 nm激光治疗的OTTBF NPs组肿瘤温度达到52.7℃，高于单纯1064 nm激光治疗的OTTBF NPs + 808 nm组(47.8℃)和40.2℃组。虽然与对照组(PBS治疗组)相比，+ 808 nm的OTTBF NPs治疗组肿瘤生长明显受到抑制(肿瘤生长抑制，TGI = 59%)，但治疗15天后，治疗效果仍低于+ 1064 nm的OTTBF NPs治疗组(TGI = 81%)。这种优越的治疗效果主要归因于NIR-II窗口的高透光性以及该区域OTTBF NPs的强捕光能力。此外，在给药期间，小鼠的体重没有明显变化。这些结果提供了坚实的证据，证明在NIR-II激光照射下，OTTBF NPs对深部肿瘤具有有效的光热抑制作用。
总结
在这项工作中，我们开发了一种出色的NIR-II二氟化硼桥接阿唑芬二聚体受体集成小有机PTA (OTTBF)用于光子深层肿瘤热疗抗肿瘤治疗。π共轭阿唑芬二聚体主链中的B-N配位键使其具有很强的吸电子能力，有利于形成活泼的D-AD结构，形成强烈的NIR-II吸收带。OTTBF的高MEC (7.21× 104 M-1 cm-1)使其在NIR-II窗口具有较高的光收集能力。利用两亲性聚合物DSPE-PEG2000制备水分散纳米颗粒(NPs)，在1064 nm光密度低至0.7 W cm-2的照射下，OTTBF NPs实现了高达50℃的显著温度增强，这可能是PTT中报道的最低NIR-II光功率。此外，超高的化学和光稳定性使OTTBF NPs更适合于生物应用。综合理论计算表明，OTTBF具有较低的HOMOLUMO能隙，且在光激发下发生较强的非辐射弛豫。由于其优异的性能，OTTBF NPs已成功应用于0.7 W cm-2 1064 nm激光下的体内和体外深部肿瘤治疗。本研究不仅提出了一种可替代NIR-II活性的小型有机PTA，而且为未来设计用于生物医学应用的NIR-II吸附性PTA提供了总体指导和探索。
参考文献
BF2-Bridged Azafulvene Dimer-Based 1064 nm Laser-Driven Superior Photothermal Agent for Deep-Seated Tumor Therapy，Mingwang Yang, Xinwen Ou, Jianwei Li, Jianwei Sun, Zheng Zhao*, Jacky W. Y. Lam* , Jiangli Fan* , Ben Zhong Tang*, Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202407307，https://doi.org/10.1002/anie.202407307
