内容提要
由于报告基因相关可见/NIR-I生物发光成像的广泛应用，可见/NIR-I/NIR-II多路荧光成像在生物医学研究中具有良好的潜力。然而，由于缺乏合适的荧光团，在这些区域的体内多路成像应用很少被报道。本文合成了9种具有不同吸附和发射波长的方酸染料。其中水溶性的SQ 710−5k和SQ 905在吸收上存在显著差异，从而可以识别肿瘤和淋巴结。然后，通过与报告基因相关的生物发光荧光粉协调，首次实现了可见光/NIR-I/II的六通道多路荧光成像。SQ 710−5k在NIR-II中表现出更高质量的血管和肿瘤成像。H聚集体SQ 905在光热治疗中表现出较高的光热转换效率。本研究提出了一种制备小分子染料的方法，该染料与报告基因相关的生物发光荧光粉协调，用于六色荧光成像。
结果与讨论
Squaraine探针的设计、合成和表征
一般来说，减小HOMO - LUMO间隙是抑制探针红移吸收/发射的有效方法。我们通过扩展共轭并增强ICT到NIR-I到NIR-II窗口的红移荧光波长，设计并合成了一系列squaraine探针。组装方酸探针结构的关键步骤包括亲核取代和Knoevenagel缩合。所有化合物均通过核磁共振(NMR)波谱(1H和13C)、电喷雾电离低分辨率(ESI-LR)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行了验证。然后，测量它们在二氯甲烷和甲醇溶液中的归一化吸收和发射光谱。对于方卡因荧光团，供体攻击方酸(亲核试剂)形成中间的半方卡因。施主(亲核试剂)的下一次攻击与随后的另一个醇或乙酸分子的消除发生在3位，产生方酸染料。碘离子没有参与这个反应。因此，方形荧光团SQ 642、SQ 672、SQ 907、SQ 909、SQ 897、SQ 905、SQ 939和SQ 965以两性离子状态存在，而不是作为碘化物反离子存在。对于氨基方酸染料，由于三氟酸甲酯的甲基化和KI的离子置换，sq710−5k存在于碘离子反离子中。SQ 642、SQ 672、SQ 710−5k、SQ 907、SQ 909、SQ 897、SQ 905、SQ 939和SQ 965的最大吸收波长分别为634、664、682、725、784、817、858、878和934 nm。发射峰分别为642、672、710、907、909、897、905、939和965 nm。结果表明，SQ 939和SQ 965比SQ 642和SQ 672具有更显著的Stokes位移。我们推测，由于供体的给电子能力增强，ICT对SQ 939和SQ 965的适度斯托克斯位移负责同样，SQ 907、SQ 909和SQ 897表现出较大的Stokes位移，这是由于染料的对称性被打破以促进ICT。特别是不对称方形荧光团SQ 897具有宽吸收和低量子产率的特点。结果与B3LYP/6-31g(d)的密度泛函理论(DFT)计算结果一致。DFT计算表明，HOMO - LUMO带隙从SQ 642逐渐减小到SQ 965。对于对称荧光团，随着给电子能力的增加，发射波长逐渐红移。从SQ 642到SQ 965, LUMO能级依次下降。在化学结构上，HOMO的电子密度沿聚甲基链在所有共轭骨架上都有离域分布;LUMO轨道主要定位于探针的受体部分。接下来，我们以NIR-I中的Oxazine 1和NIR-II中的IR-26为参考，测量了这些探针的量子产率。考虑到光学性质，我们选择了水溶性改性SQ 672和SQ 939用于进一步的生物医学应用。
基于上述光谱数据，我们总结了方炔的结构-光学性质关系。给体修饰是减小HOMO - LUMO间隙和调谐波长的常用措施。制备的非对称荧光团比对称荧光团具有更宽的吸收波长和斯托克斯位移。这可能是由于不完全的电子离域和促进ICT的染料对称性的破坏。此外，增加给体的共轭体系也是实现对称方形荧光团变色的有效途径。发射波长逐渐向深色偏移，增加了SQ 642、SQ 672、SQ 939和SQ 965给体的共轭体系。对于不对称方形荧光团，我们查阅了相关文献。以2,3,3-三甲基苯并[e]吲哚和2,3,3-三甲基吲哚为电子给体单元，与方酸对称缩合，构建msq4。msq4的吸收波长为650 nm，发射波长为657.5 nm。与msq4相比，以2,3,3-三甲基吲哚和苯并[c,d]吲哚啉为供体的sq907呈现明显的色移。增加给体的共轭体系是实现不对称方形荧光团变色的一种实用方法。因此，在末端部分引入熔融环或凝聚环会导致吸收/发射波长发生色移，尤其是凝聚环。在体内应用中，我们在N原子上引入丁基磺酸，其吸收波长发生了异色位移，摩尔消光系数低，Stokes位移宽。在水溶液中，SQ 905的吸收通常是一种异色位移，因为SQ 905通过疏水平面SQ 905部分之间的强π−π相互作用形成H聚集体。而SQ 905的发射波长没有变化。SQ 905在水溶液中比在甲醇溶液中有更宽的斯托克斯位移。通过分子内能量传递使激发态迅速猝灭，可以得到较低的摩尔消光系数修改受体也是一种很有前途的调整光学性能的方法。引入二氰亚胺增强了中心四元环的吸电子能力，导致吸收波长红移，量子产率降低。然后，我们可以用聚乙二醇修饰受体，生成具有吸收波长红移、大斯托克斯位移和低摩尔消光系数的水溶性荧光团。
SQ 905和SQ 710−5k的合成与表征
由于光化学稳定性差，我们没有选择更红移的SQ 965进行进一步的水溶性修饰和成像应用。SQ 965在不同pH缓冲溶液下不稳定，干扰荧光定量，影响结论的可靠性。基于这些缺点，我们选择SQ 939进行水溶性改性。水溶性SQ 905在不同pH缓冲溶液中表现出优异的稳定性。我们选择SQ 672进行水溶性修饰，因为该化合物可用于NIR-I和NIR-II区域的成像。虽然SQ 672和SQ 939具有优异的光学性能，但其广泛的π共轭体系的疏水性进一步限制了其在体内的应用。目前，引入磺酸基团(如ICG、CH-4T、31 IR 820、32 FD-1080、33和LZ-1105、3)或聚乙二醇化(如CH1055-PEG、34 TQP nK、35和L6 PEGnk 36)是提高水溶性的两种常用方法。因此，我们用N原子上的丁基磺酸合成了SQ 905，用NH2 - PEG5k偶联制备了SQ 710 - 5k，收率很高。。然后，研究了SQ 905和SQ 710−5k在不同溶剂中的光物理性质。SQ 905在近红外区表现出强烈的吸光度，在水溶液中的最大吸收峰为738 nm，在MeOH中红移约120 nm，达到858 nm。然后，SQ 905在MeOH中的最大发射波长为905 nm，我们在MeOH和水溶液中检测了SQ 905的荧光。SQ 905在水溶液中的荧光强度弱于在MeOH中的荧光强度，从900 - 1100 LP逐渐减弱。这些现象和光谱数据的变化与分子间π−π相互作用导致的有机溶剂中单体向水中聚集体的转变密切相关。其次，SQ 710−5k水溶液中的吸收和发射波长分别为682 nm和710 nm。SQ 710−5k在MeOH和水溶液中的吸收和发射峰相同。结果表明，SQ 710−5k在水中不形成j聚集体。同时，对SQ 905和SQ 710−5k在808 nm和660 nm激光连续照射25 min下的光稳定性进行了研究。结果表明，SQ 905和SQ 710−5k的荧光强度与商用染料ICG相比几乎没有变化，显示出良好的光稳定性。同样，它们在含血清的温介质中也具有优异的光稳定性。在中性PBS、生理盐水和血液中保存1周后，它们也表现出良好的稳定性。随后，我们研究了光谱特征变化的原因。
由于辐射衰减速率的降低，h -聚集体的吸收通常是低色移和荧光被猝灭。28,39,40因此，我们推断SQ 905在水中形成H聚集体是由于π−π相互作用。然后，我们研究了它在不同体积分数(fw)的MeOH和水的混合物中的吸光度和荧光光谱。738 nm处的近红外吸收逐渐增加，858 nm处的峰值明显降低，fw从10%上升到100%。同时，NIR-II荧光强度随着fw的增加而逐渐降低。吸收光谱的变化也表明SQ 905存在单体聚集平衡，证明其在不同比例的水/甲醇混合溶液中具有相同的764 nm的吸收强度。测定了不同浓度SQ 905在不同温度下的荧光强度。荧光强度随温度升高而逐渐增大，表明SQ 905在水中存在h聚集体。通过单体(cm)和聚集体(cagg)摩尔浓度的线性拟合，每个h -聚集体包含两个单体。我们推测SQ 710−5k在水溶液中自组装纳米颗粒。因此，DLS研究和TEM图像进一步验证了纳米颗粒的大小。纳米探针的尺寸约为81 nm，由DLS测定。我们还比较了D - A - D染料TQP 5k35的摩尔吸收系数和量子产率。与tqp5k相比，SQ 710−5k的摩尔吸收系数和量子产率更高，表明方酸荧光团可能具有更好的成像性能。由于具有较高的摩尔消光系数(81 100 M−1 cm−1)和量子产率(1.94%)，在660 nm激发下，SQ 710−5k的荧光光谱尾部延伸到NIR-II(900−1700 nm)区域。随后，通过不同的检测器和滤光片记录NIR-I和NIR-II荧光信号。结果表明，SQ 710−5k在NIR-I和NIRII窗口均具有优异的荧光性。受此启发，我们通过使用不同的长通(LP)过滤器(水中1%脂质模拟生物软组织)，在NIR-II窗口中研究了SQ 710−5k在毛细管中的渗透深度。1000nm LP滤波器更适合进一步研究。
体内NIR-I和NIR-II多路成像
SQ 642E、SQ 672-E和SQ 939的发射带有轻微的交叉干扰，通过在管中对其二氯甲烷溶液进行成像验证。三个通道的信号强度比分别为592/34 nm时的81.3/16.7/3,624/40 nm时的18/76.8/5.2,808 nm时的0/0.6/99.4 nm。为了评估SQ 642-E、SQ 672-E和SQ 939的体内多路成像能力，我们将它们溶解在5% DMSO和PBS溶液中，并皮下注射到同一只小鼠体内。随后，我们对淋巴结进行了三通道荧光成像。结果表明，SQ 642-E、SQ 672-E和SQ 939可以同时观察到不同的淋巴结。这种出色的成像效果为进一步在体内对各种疾病的器官、组织和生物标志物进行三通道成像铺平了道路。作为概念验证，我们使用慢病毒包装系统获得表达荧光素酶、GFP、mCherry和miRFP718荧光蛋白的MM 231细胞。然后将这些细胞在完整的DMEM培养基中培养，收集用于下一个成像实验。我们使用不同荧光蛋白标记的细胞和两种探针通过不同的激发波长和检测通道进一步研究了可见光、NIR-I和NIR-II多路成像。将这三种细胞和两种荧光团皮下注射到小鼠背部。通过不同的激发激光器、检测器和检测通道对四种荧光蛋白和两种探针进行了区分。荧光素酶、GFP、mCherry、miRFP718和SQ 672-E标记细胞的荧光信号通过Si检测器收集，SQ 905的荧光信号通过InGaAs检测器收集。结果表明，这些荧光蛋白表达细胞和探针之间的信号不相互干扰，为进一步的生物学应用奠定了坚实的基础。我们希望通过可见/NIR-I和NIR-II的多路荧光成像来探索疾病过程中多个器官之间的相互作用，以加速药物开发。
由于SQ 905是SQ 939的磺酸改性版本，它在水溶液中的溶解度提高，类似于SQ 710−5k，这增强了生物相容性。因此，我们使用SQ 905和SQ 710−5k进行额外的多重荧光成像研究。SQ 710−5k和SQ 905具有良好的光学性能和显著的光谱差异，这促使我们进一步将它们应用于体内复用成像。SQ 710−5k和SQ 905的发射光谱几乎没有交叉干扰，有利于复用成像和定量分析。
小鼠的两个注射部位分别为SQ 710−5k和SQ 905。然后，通过不同的激发激光器和发射滤波器对两种探针的荧光进行区分和收集。在660 nm激发、700 ~ 750 nm带通(由700 nm长通滤光片和750 nm短通滤光片组成)下，SQ 710−5k表现出强烈的NIR-I荧光。而SQ 905几乎没有荧光。
相比之下，在808 nm激发、1000 nm长通滤光片和InGaAs相机下，SQ 905表现出明亮的红色荧光，而SQ 710−5k没有明显的荧光。然后用ImageJ软件对两种探针在不同条件下的荧光强度进行定量分析。数据显示，NIR-I区SQ 710−5k是SQ 905的81.4倍，而NIR-II区SQ 905是SQ 710−5k的18.4倍。同时，我们还使用InGaAs相机，使用1000 nm LP滤光片，测量了它们在660 nm激发下的相对荧光强度和差异。在660 nm激发下，SQ 710−5k的荧光强度是SQ 905的7.38倍，比SQ 905的81.4低11倍。
在体外实验之后，我们还对NIR-I和NIR-II区域进行了体内多路成像。肿瘤转移在临床分期中起着至关重要的作用，通常发生在淋巴系统。因此，对外科医生来说，同时进行肿瘤和淋巴系统的无创可视化是必不可少的。
基于体外效果显著，我们采用SQ 710−5k和SQ 905作为两种颜色分别突出小鼠的肿瘤和淋巴结。然后，首先静脉注射SQ 710−5k，然后在注射后72 h皮内注射SQ 905，进行体内双色成像。用Si和InGaAs相机可以在NIR-I区和NIR-II区区分和识别小鼠肿瘤和淋巴结。此外，仅通过切换激发激光器，它们也可以在NIR-II通道(>1000 nm)中显示。第二个近红外窗口(NIR-II, 1000 ~ 1700 nm)的荧光成像显示较低的组织自身荧光和较高的空间分辨率。此外，由于SQ 710−5k的血液循环时间较长，活体小鼠后肢血管和淋巴结在NIR-II区(>1000 nm)分化明显。结果表明，squaraine染料可用于NIR-I/II区域或仅用于NIR-II区域的生物医学复用成像。
SQ 710−5k的体内血管和4T1肿瘤成像
据报道，许多疾病，如中风，和心血管疾病，都与血管功能障碍有关。血管功能的实时动态监测对于疾病进展的临床前研究至关重要。一般来说，与小分子相比，聚乙二醇化策略表现出延长的血液循环寿命。通过测量血液荧光强度的变化来计算探针的血浆半衰期。SQ 710−5k的血液半衰期为0.65 h。然后，我们进行了体内血管NIR-I和NIR-II成像。注射SQ 710−5k后，在不同的近红外窗口下，在周围背景组织中可以识别出清晰的血管信号。为了比较成像性能，我们使用高斯拟合半最大值全宽度(fwhm)定量分析后肢血管。根据结果，计算出所选血管的fwhm值分别为1.05 mm (NIR-I, 716/47 nm带通(BP))和0.65 mm (NIR-II, 1200 nm长通(LP))。信号背景比(SBR)分别为1.24和1.99。与NIR-I区相比，NIR-II区的分辨率和SBR分别提高了40%和60%。结果表明，NIR-II荧光成像在SBR较高的深层组织中提供了更高的时空分辨率。这表明当染料可以在NIR-I和NIR-II窗口中成像时，NIR-II成像可能是一个更好的选择。
经聚乙二醇修饰后的两亲性自组装纳米颗粒不仅增加了水溶性，延长了血液循环寿命，而且通过增强渗透性和滞留性(EPR)效应，通常赋予探针肿瘤积累能力，可用于外科导航。随后将SQ 710−5k用于荷瘤小鼠体内成像，以验证方卡因荧光团的肿瘤靶向成像潜力。首先，为了探索SQ 710−5k的毒性，采用标准CCK-8法检测小鼠胚胎成纤维细胞系(3T3)和小鼠乳腺癌细胞(4T1)的细胞存活率。在SQ 710−5k中孵育24小时后，即使浓度高达100 μM，细胞也显示出90%以上的存活率。这一显著结果表明SQ 710−5k具有低细胞毒性和良好的生物相容性。然后，我们评估了SQ 710−5k的细胞摄取。与3T3相比，4T1细胞在4小时内摄取更多。结果表明，SQ 710−5k具有对癌细胞进行体内成像的潜力。我们推测SQ 710−5k的细胞摄取机制可能由于自组装纳米颗粒而引起依赖于小泡的内吞作用同时，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)显示细胞质中有强烈的红色荧光，表明癌细胞有效吸收SQ 710−5k。
体内荧光成像显示，SQ 710−5k在静脉注射后，由于PEG链的存在，主要被肝脏和肾脏代谢。苏木精-伊红(H&E)分析未显示病理改变或器官损伤。然后进行体内肿瘤成像研究。将4T1荷瘤BALB/c小鼠(n = 3)静脉注射SQ 710−5k (1 mM, 100 μL)。在NIR-I和NIR-II中进行全身荧光成像。在图4中，注射后1小时肿瘤可见明显荧光。之后，背景信号随时间逐渐减弱。接下来，我们研究了不同近红外窗下不同时间点肿瘤与正常组织的比值(T/N)。结果显示，注射后48 h, NIR-II和NIR-I的T/ N分别达到最大值3.89和2.88。有趣的是，肾脏和肝脏的信号很明显，这表明这两个器官主要负责清除探针。注射后7天评估体外生物分布。H&E检查未见明显异常或主要器官损伤。基于良好的影像学结果，于注射后72h行NIR-II影像引导下肿瘤切除。将肿瘤边缘与正常组织清晰区分，然后完全切除。
SQ905的光热性能
H聚集体的独特特性，如比j聚集体更多的相互转换和振动弛豫，使其成为光热治疗的理想选择。H聚集体SQ 905在808 nm处表现出显著的吸收，适合光热处理和体内荧光成像。此外，SQ 905还表现出较高的摩尔消光系数。这些特征表明SQ 905更适合光热疗法。因此，我们接下来评估了SQ 905在水溶液中的光热性能。对SQ 905在不同激光功率密度下不同浓度下的温度变化进行了实时监测。数据表明SQ 905的光热效应具有功率密度和浓度依赖特征。808 nm激光(1 W/cm2)照射5 min后，SQ 905水溶液(80 μM)的温度从28.3℃升高到62.4℃，而在相同条件下，只有水的温度略有升高。即使经过五次加热-冷却循环，SQ 905溶液的温度也不变地升高，这表明它具有优越的光热稳定性。光热转换效率(PCE)为68.81%，有利于体内光热治疗。SQ 905的68.81% PCE值高于ICG的9.44%。此外，我们还证实SQ 905在激光照射5分钟后几乎不产生活性氧(ROS)。
SQ 905的体外和体内光热处理
采用标准CCK-8法测定SQ 905对3T3和4T1的生物相容性。4T1时SQ 905的细胞摄取随时间逐渐增加，使用NIRII荧光显微镜收集细胞内的明亮荧光。我们推测磺酸基团在SQ 905的细胞摄取中起重要作用。SQ 905的磺酸基团可以通过与膜磷脂的铵组分离子结合而起到膜锚的作用。然后，内化将作为正常膜循环过程的一部分发生，从而产生细胞内囊泡。在两种细胞系中均未观察到明显的毒性，即使浓度高达100 μM。相反，随着SQ 905浓度的增加，激光照射下细胞活力下降，当SQ 905浓度达到75 μM时，没有细胞存活。通过活/死染色验证了SQ 905的光热效应。仅用激光或SQ 905处理的细胞显示出强烈的绿色荧光，证实激光照射损伤轻微，生物相容性良好。然而，用SQ 905和激光处理的细胞显示明显的红色荧光。这些结果与CCK-8试验一致。
以体外治疗效果为基础，研究SQ 905在808 nm激光照射下对4T1荷瘤小鼠的体内PTT性能。荷瘤小鼠随机分为4组:PBS组、PBS +激光组、SQ 905组、SQ 905 +激光组。SQ 905和SQ 905 +激光组均以相同剂量6.84 μg /只小鼠直接瘤内注射。激光组荷瘤小鼠在注射后2 h接受808 nm (1.0 W/cm2)激光照射5 min。红外热像仪记录肿瘤部位的温度变化。激光照射5min后，SQ 905 +激光组肿瘤温度从34℃迅速升高到54℃，而对照组肿瘤温度仅升高6℃。同时在治疗期间每2 d监测各组肿瘤体积和体重。3个对照组肿瘤体积不断增大，14天后增大5 ~ 10倍。相比之下，SQ 905和激光照射治疗的肿瘤明显受到抑制。甚至五分之三的人被淘汰。此外，四组患者的体重差异无统计学意义，表明SQ 905在PTT治疗中具有良好的生物安全性和低的副作用。治疗结束后，分别切除各组主要脏器，进行H&E染色。tdt介导的dUTP镍端标记(TUNEL)实验和肿瘤区域的H&E染色显示癌细胞出现凋亡迹象。其他器官未见损伤或病理改变。
此外，还通过血清生化和苏木精-伊红(H&E)分析研究了SQ 905的潜在长期毒性。注射后7、14 d, SQ 905组肝脏及血清生化指标，如天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、尿素(urea)与PBS组相似。两组H&E结果均未见病理改变或器官损伤。同时，体内荧光成像显示SQ 905经静脉注射后主要通过肝脏代谢。静脉注射12小时后，探头可完全清除。
总结
我们成功合成了一系列发射光谱从NIR-I到NIR-II的方炔探针。我们系统地研究和总结了方形荧光团的结构-光学性质关系。制备的亲水分子SQ 710−5k和SQ 905具有优异的光学性能，特别是较高的摩尔消光系数和光稳定性。利用不同的探测器实现了SQ 642-E、SQ 672和SQ 939的NIR-I/II三通道成像。受此鼓舞，我们将NIR-I/II多路成像扩展到可见/NIR-I/II多路成像。通过两种探针和不同荧光蛋白和荧光素酶标记的细胞进行六色荧光成像。由于没有光谱串扰，我们还使用SQ 710−5k和SQ 905进行了体内双色成像，以区分NIR-I/II区域的肿瘤和淋巴结。SQ 710−5k可以自组装成纳米颗粒，以改善血液循环和肿瘤靶向。与NIR-I相比，NIRII区域的血管和肿瘤的成像效果更好。SQ 905通过分子间π−π堆积形成H聚集体，在水溶液中具有优异的PTT性能。同时，SQ 905在淋巴引流系统中也显示出良好的成像潜力。我们相信这项工作将为可见光/NIR-I/II多路成像和探测器的发展提供强大的和通用的指导。J聚集体具有显色转移吸收和发射的优点，有利于体内成像。因此，未来我们还将通过不同的反离子和配合物来探索方酸探针的J聚集体。
参考文献
Systematic Structural Modification of Squaraine Dye for NearInfrared Window One and Two Multiplexed In Vivo Imaging and Photothermal Therapy， Ruihu Song, Yiyun Dong, Zhuoyi Zhong, Qi Zhao, Yue Hu, Meiling Lei, Peng Lei, Zhaoning Jiang, Kun Qian, Chenchen Shi, Zhong He, Ye Qin, Jing Wang, and Hao Chen*，J. Med. Chem. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c00601
