内容提要
光动力疗法(PDT)利用I型光反应，由于其比常用的II型光反应具有耐缺氧的优势，因此作为一种有效的癌症治疗方法具有很大的潜力。开发了几种I型光敏剂;然而，它们主要诱导细胞毒性，具有较差的肿瘤特异性和低效率的治疗。为了解决这一问题，本文报道了一种氨基肽酶N (APN)激活的I型光疗探针(CyA)用于抗缺氧PDT与免疫治疗相结合，以有效治疗癌症。CyA可以特异性激活APN诱导的底物裂解后的近红外荧光、光声信号和光毒性以及随后产生的活性光疗分子(如CyBr)。在常氧和缺氧条件下，CyA对过表达APN的肿瘤细胞具有特异性的成像能力和有效的光毒性。此外，局部可激活的PDT诱导全身抗肿瘤免疫反应。更重要的是，与单独治疗相比，局部活化PDT和全身免疫治疗的结合可以增强治疗效果，提高活小鼠的肿瘤抑制效率。本研究旨在提出一种可激活的光疗探针，用于有效的耐缺氧PDT和联合治疗。
实验结果与讨论
APN活化光治疗探针的合成与活性氧(ROS)产生的体外研究
设计了一种APN激活的光疗探针(CyA)，该探针具有近红外荧光光声信号和光治疗片段(CyBr)，通过自毁连接剂与APN切割的底物Ala结合。由于羟基在“笼”状态下的电子提供能力减弱，CyA最初是非光活性的。遇到APN后，Ala与自溶连接体之间的酰胺键发生特异性断裂，随后发生1,6-消除过程，释放出具有活性的光活性分子(CyBr，“未束缚”状态)。因此，由于CyBr的氧原子提供电子的能力增加，从而恢复ICT过程，所产生的产物的荧光光声信号和光毒性被激活。
为了评估CyA检测APN的能力，在APN不存在或不存在的情况下，测量CyA的吸收、荧光和PA光谱。CyA在602 nm处有一个吸收峰，摩尔消光系数为3.0 × 104 M−1 cm−1，最小荧光强度为0.009，量子产率(Φf)为0.009，与CyBr相比具有较高的信号对比度。在APN (200 ng mL−1)存在下，CyA在692 nm处有一个新的吸光度峰，随着孵育时间延长至2 h，吸光度峰增加，这意味着APN水解后CyA完全转化为CyBr。在相同条件下，APN激活后，CyA在719 nm处的荧光强度提高了5.9倍，在700 nm处的荧光强度提高了4.9倍。
为了研究APN激活后CyA产生的ROS，分别使用单线态氧传感器绿色(SOSG)、二氢膦胺123 (DHR123)和对苯二甲酸(TA)检测1O2、O2•−和OH•。经过660 nm激光照射后，经APN处理的CyA在SOSG中有轻微的荧光增强，说明APN活化后CyA可以产生少量的1O2。此外，660 nm激光照射APN后，CyA没有产生显著水平的OH•。相比之下，DHR123的荧光强度可以显著增强3.7倍，这表明APN与660 nm激光照射后，CyA的O2•−产率相当高。经APN处理的CyA存在时，SOSG、DHR123和TA的荧光增强谱与CyBr相当，进一步证实APNactivated CyA的O2•−生成本质上来源于光照后的CyBr。以5,5-二甲基吡咯- n -氧化物为捕集剂，进一步进行了电子自旋共振(ESR)实验。g值为2.0065，耦合常数AN为14 g, AH为11 g的典型峰的出现表明CyBr产生O2•−，这是完整CyA无法实现的。这些实验表明，CyA在APN激活后可以产生O2•−，用于潜在的耐缺氧PDT。我们还研究了CyBr的光热效应。在高浓度200 μm下，激光照射10 min后，CyBr溶液的温度仅升高了5℃，表明CyBr的光热效应轻微。由此可以推断，CyA的光毒性主要是由APN介导的可活化PDT引起的。
体外活细胞成像研究
用过表达APN的小鼠乳腺癌4T1细胞评估CyA检测活细胞中APN的能力。在评估CyA感知活细胞的能力之前，使用western blot分析检测4T1细胞中APN的表达水平。这些结果验证了APN在4T1细胞中的广泛表达，这与以往的研究结果一致。随后使用该探针检测4T1细胞中的APN。CyA与4T1细胞在不同时间点孵育后，荧光强度逐渐增强，在≈2h时达到最大信号。在APN抑制剂BT的存在下，CyA处理的细胞发出的如此明亮的荧光信号被抑制了5.3倍，进一步证明了CyA在4T1细胞中被APN过表达特异性激活。
研究了CyA与4T1细胞孵育后的PA图像和光谱。，在700 nm处，CyA处理的4T1细胞微球有明显的PA信号，比CyA联合BT处理的4T1细胞微球的PA信号高2.9倍，证实了CyA对4T1细胞PA成像的适用性和特异性。此外，经CyA处理的4T1细胞活化后的PA谱与体外APN活化后的CyA PA谱相似，说明活化的PA信号是由4T1细胞中APN过表达引起的。这些结果证明CyA可以被APN过表达在癌细胞中特异性激活，用于细胞成像。
随后，研究了APN激活后CyA的细胞内化。由于CyA被位于膜上的APN激活产生荧光CyBr，因此CyBr被直接用于研究细胞摄取行为。低温(0℃)下CyBr的摄取显著减少，表明细胞以能量依赖的方式摄取CyBr。此外，用filipin (FLP，一种小泡介导的内吞作用抑制剂)、氯丙嗪(CPZ，一种网格蛋白介导的内吞作用抑制剂)或dynasore (DNS，一种网格蛋白和快速内啡肽介导的内吞作用抑制剂)对细胞进行预处理，以研究它们是否影响CyBr的胞吞作用。flp处理组荧光强度明显下降，CPZ和DNS处理组荧光强度无明显变化。这些数据证明CyBr很可能是通过小泡介导的内吞作用进入细胞的。为了研究APN激活后CyA在4T1细胞中的亚细胞分布，我们使用常见的亚细胞细胞器染色染料，包括Hoechst 33342(细胞核)、线粒体(Mito)-Tracker Green、溶酶体(Lyso)-Tracker Green和内质网(ER)-Tracker Green对CyA孵育后的细胞进行染色。共定位研究表明，水解产物CyBr主要分布在内质网和溶酶体中。
APN触发的可活化PDT和免疫原性细胞死亡(ICD)的体外研究
在APMN过表达的4T1细胞中检测APN介导的可激活I型光毒性。使用SOSG、二氢乙锭(DHE)和羟基苯基荧光素(HPF)分别评估光疗后活细胞中1O2、O2•−和OH•的生成。将4T1细胞置于培养箱中，在5% CO2气氛中，在21% O2和2% O2的加湿条件下培养24 h，建立常氧和缺氧环境。使用厌氧指示剂[Ru(dpp)3]Cl2 (RDPP)确认细胞内缺氧，荧光信号相对于常氧环境显著增加。经过探针孵育和660 nm激光处理后，无论在常氧环境还是低氧环境下，SOSG的荧光都没有明显增强，表明1O2的产生可以忽略不计。相比之下，在常氧和缺氧环境下，4T1细胞均观察到显著的DHE荧光信号。这些数据证明了CyA处理后活细胞中I型O2•−的高效生成，表明抗缺氧光疗可能具有很高的疗效。令人惊讶的是，我们还观察到，在常氧和缺氧条件下，经过CyA孵育和660 nm光照射后，4T1细胞中HPF出现了明显的绿色荧光，表明产生了高细胞毒性的OH•来杀死肿瘤细胞。同时，通过流式细胞术分析进一步证实了4T1细胞中I型ROS的生成( support Information)，结果一致。根据体外ROS验证，在APN激活后，OH•并不是由CyA直接生成的，根据之前的研究，OH•可能是在超氧化物歧化酶(SOD)的催化作用下由O2•−转化而来的。此外，如果用100 μm BT预处理细胞1 h, DHE和HPF的荧光信号都被有效抑制，从而验证了APN激活后CyA产生的特异性ROS。
其次，使用活细胞染色试剂盒检测CyA的体外细胞杀伤作用。4T1细胞经PBS或CyA孵育后，不经660 nm辐照，呈现强烈的绿色荧光，没有明显的红色荧光，表明细胞是活的。相比之下，光疗组在常氧和缺氧下均表现出强烈的红色荧光。使用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)和流式细胞术定量评估PDT的效果。在较低浓度下，CyA对未经激光照射的4T1细胞的毒性可忽略不计，在常氧和缺氧条件下，CyA的半最大抑制浓度(IC50)分别为119.0和113.2 μm。光照后，细胞增殖在常氧和低氧环境下均被有效抑制。此外，观察到明显的浓度依赖效应，在常氧和低氧之间的IC50分别为2.9和2.6 μm。随后，计算出CyA在常氧和缺氧条件下对4T1细胞的光毒性指数分别为41.0和43.5，与之前报道的探针相比，具有中等的光毒性。使用Annexin V-FITC/PI双染色的流式细胞术检测显示了类似的结果，在常氧或缺氧条件下，光疗组的大多数细胞死亡。此外，添加NaN3(一种1O2清除剂)不影响杀伤效果，但添加Nacetyl半胱氨酸(NAC)作为一般的ROS清除剂，杀伤效果显著降低，进一步证明了I型ROS的有效生成，可以有效杀死4T1细胞。综上所述，CyA有效诱导过表达APN的癌细胞抗缺氧光毒性。
基于之前的共定位研究，我们假设APN介导的可激活PDT可能在靶向这些细胞器后诱导内质网应激，最终导致免疫原性细胞死亡(ICD)。因此，采用western blot分析内质网应激相关蛋白，包括C/EBP同源蛋白(CHOP)和磷酸化真核起始因子2rtp (p- eif - 2rtp)。与未经激光照射的PBS和cya处理组相比，cya处理组在激光照射下CHOP和p-eIF-2的表达上调，证实了可激活PDT后内质网应激的发生。添加BT可逆转蛋白调控，抑制APN活性，进一步验证APN介导的光疗诱导内质网应激的激活。除了内质网应激外，通过测量损伤相关分子模式(DAMPs)的表达来研究pdt诱导的ICD，包括表面暴露钙网蛋白(CRT)和高迁移率组盒1 (HMGB1)，它们促进树突状细胞(DCs)的成熟和抗原呈递。免疫荧光染色显示，在没有激光照射的对照组，包括PBS和CyA, CRT对膜的暴露可以忽略不计。与此相反，光疗组暴露于CRT和HMGB1显著增加，这可以通过添加APN抑制剂逆转，表明可激活pdt介导的DAMPs表达的特异性。这些结果有力地证明pdt驱动的ROS生成可以诱导内质网应激和有效的ICD，从而引发潜在的抗肿瘤免疫。
利用流式细胞术研究了CyA光动力介导DC成熟并随后激活免疫应答的能力。未成熟骨髓源性树突状细胞(BMDCs)与光照射后CyA处理的4T1细胞共培养后，CD80+CD86+成熟dc的数量为62.4%，分别比PBS-组、未激光照射CyA组和光照射CyA与bt处理组高6.9倍、5.8倍和4.8倍。此外，混合淋巴细胞的反应表明，与其他对照组相比，CyA处理的DCs在光疗组中具有最高的免疫相关炎症因子表达水平，包括干扰素- γ> (IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6 (IL-6)。总的来说，这些结果证明了CyA对apn激活的PDT介导的有效免疫刺激的高能力。
CyA在体内肿瘤成像的研究
为了评价APN在4T1荷瘤小鼠皮下的体内显像能力，采用活体4T1荷瘤小鼠瘤内注射CyA (50 μm, 50 μL)。随着时间的推移，荧光光声信号逐渐增加，在注射后≈3 h达到峰值。然而，与单个CyA处理组相比，bt预处理组的荧光和PA信号分别下降了2.9倍和3.2倍。这些结果证实了APN激活后的激活信号来源于CyA。此外，CyA处理组激活的PA谱与APN激活后的CyA体外谱相似，进一步验证了肿瘤中APN过表达对CyA的特异性激活。这些结果表明CyA能够特异性检测过表达apn的肿瘤。
体内CyA介导的可激活PDT
CyA联合免疫检查点阻断疗法对PDT的疗效在4T1荷瘤BALB/c小鼠中进行了检测。4T1细胞皮下接种于小鼠右侧，约6天后再次接种于同一小鼠左侧。当原发肿瘤生长到120±20 mm3时，在第0天和第2天分别瘤内注射CyA (200 μM, 50 μL)，对原发肿瘤进行0.5 W cm−2光治疗(10 min)，然后每隔一天(第1天和第3天)腹腔注射抗pd - l1 (aPD-L1, 3.75 mg kg−1)。治疗后监测原发肿瘤和远处肿瘤的体重和肿瘤生长曲线，持续12 d。各组小鼠均未见明显体重减轻。此外，PDT单独治疗和PDT与apd - l1联合治疗小鼠的原发肿瘤被完全抑制，而PBS-、无激光照射探针-或apd - l1治疗组的抗肿瘤效果明显较差。对于远处肿瘤，联合治疗组相对于单独治疗对照组的肿瘤抑制效率最高，表明联合治疗后有效的全身抗肿瘤效果。此外，原发肿瘤和远处肿瘤的权重也显示出相似的结果。此外，还在体内评价了CyA的光热效应。激光照射10 min后，小鼠肿瘤区域温度从35.6℃轻微升高至39.5℃，低于光热治疗的最低温度42℃，表明CyA的光热作用可以忽略不计。因此，可以得出结论，抗肿瘤作用主要是由apn触发的可激活PDT引起的。进一步分析不同处理后的组织学变化。TUNEL染色显示，联合治疗组肿瘤组织中细胞凋亡发生率高于其他组。作为肿瘤增殖和侵袭性的特征性标志物，Ki67免疫组化染色表明，联合治疗组高增殖肿瘤细胞数量相对于其他组大大减少。
CYA介导的PDT治疗免疫激活
为了进一步了解治疗后的免疫反应，我们测量并比较了肿瘤引流淋巴结的DC成熟和细胞因子释放。首先，使用流式细胞术检测和分析肿瘤引流淋巴结中CD11c+CD80+CD86+成熟DC的总体。联合治疗组淋巴结成熟dc的水平最高(49.6%)，分别比PBS-、单个CyA-、单个aPD-L1-和PDT治疗组高2.4倍、1.9倍、1.6倍和1.2倍。为了确定促炎细胞因子的表达水平，包括IL-6、TNF- rnd和IFN- <s:1>，治疗后取小鼠血液样本。与DC成熟结果一致，与其他组相比，联合组的IL-6、TNF- rr和IFN- <s:1>分泌水平显著增加。这些数据表明CyA介导的PDT联合免疫治疗具有更好的抗肿瘤免疫活性。
为了研究CD8+ T淋巴细胞在对抗癌细胞中的丰度，流式细胞术用于分析治疗后原发肿瘤和远处肿瘤中CD3+CD8+ T淋巴细胞的群体。联合治疗后原发肿瘤中CD8+ T细胞的数量达到40.1%，明显高于对照组，包括PDT-组(32.6%)、aPD-L1-组(27.1%)、CyA-组(15.9%)和pbs -组(11.7%)。CD8+ T细胞免疫荧光染色显示类似结果。与其他对照组相比，在远处肿瘤中，联合治疗后CD3+CD8+ T淋巴细胞的数量也有所增加。这些数据证明，与单一疗法相比，CyA介导的可激活光动力免疫疗法大大提高了全身抗肿瘤t细胞免疫。
越来越多的证据支持骨髓源性抑制细胞(MDSCs)在癌症免疫应答的负性调节中的作用。当肿瘤发生时，大量的MDSC聚集在各种器官中，通过与细胞直接接触或通过分泌因子抑制T细胞的正常免疫功能。因此，使用流式细胞术评估原发肿瘤的阴性免疫反应。与其他各组相比，联合治疗后小鼠脾脏中CD11b+Gr-1+ MDSCs的数量分别较其他对照组减少最多。在原发肿瘤中也观察到类似的现象。综上所述，免疫抑制微环境的降低进一步验证了CyA介导的光动力免疫疗法具有优越的抗肿瘤功效，有效地抑制了肿瘤的生长。
总结
我们设计并合成了一种APN激活光治疗探针(CyA)，该探针具有激活的荧光光声信号引导PDT和免疫疗法，可有效治疗肿瘤。CyA特异性激活APN高表达的4T1细胞的近红外荧光和PA信号。APN介导的光活性CyBr在常氧和缺氧条件下均能产生O2•−。在原发肿瘤光动力照射下，CyA不仅对肿瘤细胞表现出强烈的光毒性，而且诱导了明显的抗肿瘤免疫反应。通过整合活化的PDT和aPD-L1免疫疗法，与单独治疗相比，获得了更好的治疗效果，包括抑制活体小鼠的原发性和远处肿瘤。总之，这项研究为开发一种可激活的光治疗探针提供了一种通用但有效的策略，用于抗缺氧PDT和联合治疗。值得注意的是，该系统存在一些局限性，如近红外光作为辐射源的穿透深度较浅，I型ROS生成效率相对较低。因此，需要研究具有深层组织穿透源(即声波)照射的I型光化学反应的新型治疗剂的进展，以及ROS生成的优化，以充分探索其在肿瘤治疗中的应用。
参考文献
An Activatable Phototheranostic Probe for Anti-hypoxic Type I Photodynamic- and Immuno-Therapy of Cancer ，Min Zhao, Yuyang Zhang, Jia Miao, Hui Zhou, Yue Jiang, Yuan Zhang, Minqian Miao, Wan Chen, Wei Xing,* Qing Li,* and Qingqing Miao*， Adv. Mater. 2024, 36, 2305243 ， https://doi.org/10.1002/adma.202305243
