内容提要
胰腺癌组织中致密的细胞外基质(ECM)严重阻碍了纳米药物的渗透，导致治疗效果不佳。为了解决这一问题，构建了一种多功能脂质体，即Lip - DTI /NO，将I型光敏剂DTITBT与谷胱甘肽(GSH)或热反应性一氧化氮(NO)供体S-亚硝基-N -乙酰-青霉素胺(SNAP)整合，以消耗肿瘤ECM，从而增强药物传递，从而改善光疗。负载的DTITBT具有NIR-II荧光成像、高效的超氧自由基O2•−生成和优异的光热转换效率等多种功能，使其在光疗过程中精确定位肿瘤成为可能。响应细胞内过表达谷胱甘肽或DTITBT光热效应产生的热量，NO可以从SNAP中释放出来。在808 nm激光照射下，Lip-DTI/NO可选择性诱导肿瘤原位生成过氧亚硝酸盐阴离子(ONOO−)，经过O2•−生成、GSH或热触发NO释放等级联过程，O2•−与NO快速反应。生成的ONOO−可以激活内源性基质金属蛋白酶的表达，有效地消化肿瘤ECM中的胶原，从而促进了Lip - DTI /NO在肿瘤中的渗透和积累。体内评价表明，通过ONOO−增强的协同光动力-光热疗法对皮下和原位胰腺癌模型的治疗效果显著。
实验结果与讨论
AIEgen的合成和Lip-DTI/NO的制备与表征
构建强供体-受体(D-A)结构是开发高效NIR吸收光敏剂的公认策略。在DTITBT中，富电子的噻吩[3,2-b]吲哚(TI)显著提高了给电子核的给电子能力，与强吸电子单元苯并[1,2-c:4,5c ']双([1,2,5]噻二唑)(BBT)相互作用，导致了强烈的分子内电荷转移和理论计算的1.2 eV的窄带隙。在THF溶液中，DTITBT表现出广泛的吸收，最大吸收波长为756 nm (16728 L mol-1cm-1)，近红外辐射峰值为1085 nm。DTITBT在THF/H2O混合物中表现出典型的AIE性质。为了使疏水性DTITBT具有良好的水分散性能和生物相容性，采用两亲性聚合物DSPE-mPEG2000，通过纳米沉淀法将DTITBT组装成纳米颗粒(NPs)。通过透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)测量显示，制备的DTITBT NPs具有均匀的球形形貌，平均直径约为83.5 nm。DTITBT NPs具有一些有趣的光治疗特性。连续近红外激光照射后，DTITBT NPs在水、PBS和10% FBS中表现出优异的耐光漂白性能，它们的水溶液在776 nm处吸收最大，NIR-II的发射在1106 nm处达到峰值，在900-1500 nm的发射范围内，量子产率为0.4%。DTITBT的这些特性有利于生物组织中具有深层穿透性的NIRII荧光成像。采用2′，7′-二氯二氢荧光素二醋酸酯(DCFHDA)、9,10-蒽二基双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)和羟基荧光素(HPF)分别监测总ROS、1O2和•OH的生成。在DTITBT NPs存在的情况下，808 nm激光(0.8 W cm−2)照射10 min后，DCFH的荧光强度比初始强度显著增强了400多倍，而仅DCFH- da组的荧光强度没有明显变化，可见DTITBT NPs整体ROS生成效率优异。然而，808 nm激光(0.8 W cm−2)照射DTITBT NPs后，ABDA的吸收强度没有明显变化，表明DTITBT NPs中ii型PDT路径产生的1O2受到抑制。此外，在808 nm激光照射下，HPF探针在DTITBT NPs存在的情况下，荧光强度没有增加，说明DTITBT NPs不能产生•OH(Supporting Information)。以5,5-二甲基-1-吡咯啉- n-氧化物(DMPO)为自旋诱捕剂，通过电子顺磁共振(EPR)谱进一步证实了O2•−的生成。对照组的共振信号可以忽略不计，而在808 nm激光照射下，DMPO和DTITBT分子存在时，可以观察到明显的EPR信号，证明了O2•−槽型I型PDT路径的高效生成。DTITBT分子内电荷转移强，单重态-三重态能隙小(∆EST = 0.69 eV)，促进了与pdt相关的系间交叉过程，使DTITBT NPs具有优异的光敏能力。DTITBT NPs也表现出优异的光热转换性能。根据文献，基于一个热-冷循环，DTITBT NPs的光热转换效率估计约为43%。当DTITBT NPs水溶液浓度从20 μg mL−1增加到200 μg mL−1时，808 nm激光照射10 min后，温度从49°C升高到66°C，呈现出浓度依赖性的温度升高。此外，DTITBT NPs的光热性能在经过六次加热和冷却过程后变化可以忽略不计，表明这种NPs具有出色的光热稳定性。以上研究表明，DTITBT具有NIR-II荧光发射、O2•−生成效率高、光热转换效率高等特点，是一种高效的光疗材料。
我们利用脂质体作为纳米载体来加载DTITBT和SNAP。通过膜-超声分散法，将DTITBT和SNAP分别单载或载于脂质体Lip-DTI、Lip-NO和Lip-DTI/NO中。DLS测量显示，Lip-NO、Lip-DTI和LipDTI/NO的水动力直径分别为92.6、104.5和100.2 nm, PDI分别为0.23、0.28和0.25。低温透射电镜(cryo-TEM)图像显示脂质体呈球形，大小均匀。此外，Lip-NO、Lip-DTI和Lip-DTI/NO的zeta电位分别为- 13.8、- 13.6和- 14.2 mV。脂质体的负表面电荷将显著促进长血液循环和最小的网状内皮系统清除率。结果表明，DTITBT和SNAP可以很容易地共包合成水溶性良好的脂质体，并具有良好的稳定性。
ONOO−生成的体外评价
在体外实验中，根据我们的假设，LipDTI/NO可以选择性地诱导ONOO-生成，其中包括808 nm激光照射引起O2•−和热量的产生，热/ GSH触发SNAP释放NO, O2•−和NO之间的快速反应。Lip-DTI/NO的热量和GSH响应性来源于SNAP分子。DTITBT分子在300-450 nm范围内具有很高的消光系数，与SNAP分子的吸收光谱重叠。为了消除DTITBT吸收对响应性测试的干扰，我们评估了SNAP脂质体(Lip-NO)的热响应性和GSH响应性。将含有5 × 10−3 M SNAP的Lip-NO加入96孔板中。将孔板置于激振器中，温度分别为37℃和60℃，通过微孔板读取器测量不同时间点Lip-NO在340 nm左右的特征吸收谱。Lip-NO在37℃孵育4 h后紫外-可见吸收光谱无明显变化，说明Lip-NO在37℃下具有良好的储存稳定性。60℃孵育后，NO的释放速度明显加快。60℃孵育4 h后，70%以上的Lip-NO被分解。接下来，研究GSH触发的Lip-NO释放NO。将含有5 × 10−3 M SNAP的Lip-NO与不同浓度的GSH孵育，并在37℃下连续振荡。然后用Griess试剂盒(Beyotime, S0021S)检测剩余NO含量。生理环境下Lip-NO不能释放NO。在低浓度GSH (2 × 10−6 M)孵育4 h后，Lip-NO释放的No不超过40%，而在高浓度GSH孵育后，No的释放速度大大加快。10 × 10−3 M GSH孵育0.5 h后，Lip-NO释放出90%以上的NO。由于DTITBT的光动力学特性和热/ gsh触发SNAP释放NO的特性已经得到证实，我们在体外对近红外光控制的ONOO−生成进行了评估。以二氢霍达明123 (DHR123)为荧光探针，经ONOO−氧化生成在505 nm处有特征吸收峰和530 nm处有强发射峰的罗丹明123 (RH)。808 nm激光照射前后Lip-DTI的吸收光谱没有明显变化。而在808 nm激光照射下，Lip-DTI/NO溶液的吸收光谱在505 nm处出现明显的强吸收峰。类似的结果也反映在PL光谱的变化上。在808 nm激光照射下，Lip-DTI组出现微弱的荧光发射信号，这可能是由于DTITBT产生的O2•−氧化能力较弱，将少量DHR123氧化为罗丹明123。而Lip-DTI/NO组在808 nm激光照射下，荧光强度显著增强，说明溶液中产生的ONOO−能够有效氧化DHR123生成罗丹明123。此外，随着SNAP加载浓度的增加，RH的吸光度和PL信号明显增强，揭示了ONOO−的浓度依赖性生成。这些结果证实了Lip-DTI/NO在808 nm激光照射下可以有效地生成ONOO−，且生成量与SNAP浓度和激光照射时间呈正相关。
细胞内ONOO−生成及体外抗癌活性评价
考虑到细胞内LipDTI/NO的ONOO -生成对体内光疗至关重要，我们使用相应的荧光探针评估PANC-1癌细胞中脂质体的NO释放、ROS和ONOO -生成。用脂质体和各种荧光探针孵育PANC-1癌细胞，PBS缓冲液洗涤，808 nm激光照射5 min，荧光显微镜下观察荧光图像。NO基脂质体(Lip-NO和Lip-DTI/NO)处理的NO生物探针显示出强烈的红色荧光，表明NO在细胞内还原环境下有效释放。采用DCFH-DA评价总ROS产量。LipDTI/NO或Lip-DTI + 808 nm激光照射处理的DCFH-DA探针显示出明显的亮绿色荧光，而对照组(PBS、Lip-NO和Lip-DTI/NO不加808 nm激光照射组)几乎没有观察到明显的荧光信号，说明DTITBT分子+激光照射可以在PANC-1细胞中产生高效的ROS。由于NO能与ROS快速反应生成ONOO−，我们进一步使用ONOO−检测试剂盒(BBoxiProbe O58)检测细胞内ONOO−水平。与Lip-DTI/NO在808 nm激光照射下孵育后，PANC-1癌细胞中观察到强烈的红色荧光，表明NO和ROS在细胞内反应产生了丰富的ONOO−。而对照组(Lip-DTI加808 nm激光照射、Lip-NO或Lip-DTI/NO不加808 nm激光照射)则呈现轻微的红色荧光，说明肿瘤中少量内源性ROS或NO可以相互作用，产生少量ONOO−。流式细胞术定量测定细胞内NO、ROS和ONOO−的代数。与对照组相比，Lip-DTI/NO + 808 nm激光照射处理的PANC-1细胞的平均荧光强度最高，这与荧光显微镜结果一致。采用CCK-8法评价三种脂质体对NIH3T3细胞的体外细胞毒性。不同浓度Lip-NO、LipDTI或Lip-DTI/NO在暗处孵育24 h后，NIH3T3细胞的细胞存活率均在85%以上，说明Lip-NO、Lip-DTI或Lip-DTI/NO具有良好的生物安全性。由于DTITBT分子具有优异的光热性能和ROS生成，通过CCK8法定量评价LipDTI对PANC-1细胞的体外光疗效果。即使在黑暗条件下高浓度100 μg mL−1,Lip-DTI对PANC-1细胞的细胞毒性也可以忽略不计，表现出良好的生物相容性。而在808 nm激光(0.8 W cm−2)照射5 min时，Lip-DTI对PANC-1细胞表现出剂量依赖性的细胞毒性。
ONOO−，MMPs和胶原耗竭的体内评价
通过皮下接种PANC-1/NIH313细胞混合物(1:1)建立富间质小鼠模型，进行体内实验。将肿瘤体积大致相同的荷瘤BALB/c裸鼠随机分为6组:i)单独PBS;ii) 808 nm激光照射PBS;iii) Lip-DTI单独;iv) 808 nm激光照射Lip-DTI;v) Lip-DTI/NO单独;vi) 808 nm激光照射Lip-DTI/NO。静脉注射脂质体后，激光照射组小鼠在注射后2和5 h分别接受808 nm激光(0.31 W cm−2)照射5 min。首先评价不同治疗方法对ONOO−in肿瘤生成的影响。由于ONOO−在肿瘤组织中的不稳定性，很难在体内直接测定。ONOO−的产生通常通过氧化硝化作用促进蛋白质中的酪氨酸转化为3-硝基酪氨酸(3-NT)，因此3-NT通常被用作检测ONOO−活性的生物标志物。采用3-NT免疫组化染色评价不同处理后ONOO−在体内的生成情况。与pbs处理组相比，lipdti处理组无法诱导肿瘤组织出现明显的3-NT。而未经808 nm激光照射的Lip-NO和Lip-DTI/NO处理的小鼠肿瘤组织中3-NT分别增加了9倍和11.1倍。这可能是由于肿瘤中存在少量内源性ROS和gsh触发的NO释放，两者相互作用生成ONOO−。而在LipDTI/NO + 808 nm激光照射组，3-NT水平增加28.3倍，表明肿瘤组织中产生了丰富的ONOO−。综上所述，DTITBT和SNAP联合给药加上808 nm激光照射可诱导肿瘤组织中大量的ONOO−。在肿瘤组织中LipDTI/NO生成良好的ONOO -的鼓舞下，我们探索了不同处理后ONOO -对肿瘤组织中MMPs表达水平的影响。获得了两种研究充分且具有代表性的MMPs (MMP-1和MMP-2)的Western blot结果和相应的定量分析。与pbs处理组相比，Lip-NO或Lip-DTI加激光照射或LipDTI/NO不加激光照射的小鼠肿瘤组织中MMP-1和MMP-2的表达水平略有升高，说明单独使用ROS或NO对MMPs的表达水平影响不大。而Lip-DTI/NO加808 nm激光照射后，小鼠肿瘤组织中MMP-1水平升高5.7倍，MMP-2水平升高5.1倍，表明ONOO−的高瘤内生成水平可以诱导MMPs的表达水平。为了验证增强的MMPs表达是否能改善胶原的消化，在808 nm激光照射或不照射的情况下，用免疫荧光染色法评估了瘤内注射脂质体后富含基质的异种移植肿瘤中胶原I的水平。在对照组中观察到明显的胶原I对应的绿色荧光信号，表明DTITBT分子单独或不进行激光照射对胶原I的消耗作用非常低，而Lip-DTI/NO加808 nm激光照射组的绿色荧光信号减少到PBStreated组的46%。结果证实，在富含基质的肿瘤模型中，DTITBT和SNAP在脂质体中共递送加上808 nm激光照射可诱导大量ONOO−，增加MMPs的表达，从而激活胶原消化。
增强穿透性和治疗效果
致密的ECM是脂质体渗透的主要屏障。胶原耗竭可促进脂质体在肿瘤中的渗透。为了验证这一假设，我们在富含基质的肿瘤小鼠模型上对脂质体进行了体内NIR-II荧光成像，以观察脂质体在肿瘤中的渗透和积累效率。取肿瘤体积相近的皮下NIH3T3/PANC-1荷瘤BALB/c裸鼠，随机分为4组:(1)Lip-DTI单独组;(2) Lip-DTI + 808 nm激光预辐照;(3) Lip-DTI/NO单独;(4) Lip-DTI/NO + 808 nm激光预辐照。预照射组小鼠静脉注射Lip-DTI或Lip-DTI/NO，在注射后2 h和5 h用808 nm激光(0.3 W cm−2,5 min)对肿瘤区域进行预照射。各组小鼠在注射后24 h进行体内近红外荧光成像实验。对照组小鼠肿瘤组织荧光信号极微弱。而Lip-DTI/NO + 808 nm激光预照射组肿瘤组织荧光强度最高，说明DTITBT分子在肿瘤中的积累增强。这些结果确实表明，在Lip-DTI/NO +激光预照射组，ONOO−的产生可以触发MMPs激活和胶原消化，从而提高Lip-DTI/NO的增强通透性和保留(EPR)效果。为了评估Lip-DTI/NO的光热治疗潜力，我们在NIH3T3/PANC-1荷瘤小鼠皮下进行了体内光热评价。在静脉注射Lip-DTI或Lip-DTI/NO后，四组小鼠接受与上述相同的808 nm激光(0.3 W cm−2)预照射。然后，在脂质体注射后24 h，用红外热像仪实时监测所有小鼠的温度，在此期间，用808 nm激光照射肿瘤，以更高的功率密度(0.6 W cm−2,5 min)进行光热成像。808 nm激光照射后，808 nm激光预照射Lip-DTI/ no注射小鼠的肿瘤区域温度在5 min内从35℃迅速升高到51.9℃，显示了PTT应用的巨大潜力。正如预期的那样,温度海拔(△T = 16.9°C) Lip-DTI /不加808 nm激光preirradiation组明显高于对照组(组1:Lip-DTI没有波长808纳米的激光preirradiation(△T = 7.6°C),组2:Lip-DTI与波长808纳米的激光preirradiation(△T = 9.2°C)和组3:LipDTI /不没有波长808纳米的激光preirradiation(△T = 11.5°C)),表明DTITBT更有效积累的肿瘤由于胶原蛋白消化。由于ECM的胶原消化可以增加脂质体的渗透，Lip-DTI/NO的光疗效果也可能增强。为了验证这一假设，我们在NIH3T3/PANC-1皮下肿瘤模型上评估Lip-DTI/NO的光疗作用。将肿瘤体积大致相同的BALB/c裸鼠随机分为6组:(i)单独PBS;(ii) PBS + 808 nm激光预照射;(iii) Lip-DTI单独;(iv) Lip-DTI + 808 nm激光预辐照;(v) Lip-DTI/NO单独;(vi) Lip-DTI/NO + 808 nm激光预辐照。预照射组小鼠静脉注射PBS或Lip-DTI或Lip-DTI/NO，在注射后2和5 h用808 nm激光(0.3 W cm−2,5 min)预照射肿瘤区域，进行胶原消化。注射后24小时，将所有组小鼠暴露在808 nm更高功率密度(0.8 W cm−2,5 min)的激光照射下进行肿瘤消融。在15天的治疗期内，每隔一天监测各组小鼠的肿瘤体积和体重，以评估各组的治疗效果。治疗结束后，将所有小鼠安乐死，取肿瘤照相并称重。如图5d所示，对照组(i组和ii组)的肿瘤体积在整个治疗期间持续增加，无论光照射如何，这表明单独808 nm激光照射没有任何抗肿瘤效果。与pbs处理组相比，Lip-DTI或Lip-DTI/ no处理组对肿瘤生长的抑制作用更强，这是由于DTITBT分子具有良好的光疗作用。此外，808 nm激光预照射(vi组)的Lip-DTI/NO在治疗15天后表现出最佳的肿瘤抑制效果，显著抑制肿瘤大小，表明通过ONOO−增强光动力光热疗法，Lip-DTI/NO在基质富集肿瘤中具有显著的抗肿瘤作用。与肿瘤生长曲线相一致的是，平均肿瘤重量和代表性图像也证实了Lip-DTI/NO具有优异的抗肿瘤效果。此外，在整个治疗期间，各组小鼠的体重均略有增加，表明脂质体在体内的全身毒性可以忽略不计。
为了模拟PC的真实肿瘤微环境，将荧光素酶基因转染的PANC-1肿瘤细胞(2 × 106个/只小鼠)和NIH3T3细胞(2 × 106个/只小鼠)手术植入小鼠胰腺，建立原位PC模型，进行体内实验。将原位胰腺荷瘤裸鼠随机分为6组，1)单独PBS;ii) PBS + 808 nm激光预照射;iii) Lip-DTI单独;iv) Lip-DTI + 808 nm激光预辐照;v) Lip-DTI/NO单独;vi) LipDTI/NO + 808 nm激光预照射。各组小鼠于第0天经尾静脉静脉注射生理盐水或Lip-DTI或Lip-DTI/NO (100 μL, DTI和NO等浓度10 mg kg−1)1次。预照射组小鼠分别在注射后2 h和5 h用808 nm激光(0.3 W cm−2,5 min)对肿瘤部位进行预照射。在注射后24小时，将所有组小鼠暴露在808 nm更高功率密度(0.8 W cm−2,5 min)的激光照射下进行肿瘤消融。在第0、5、10、15和20天，捕捉荧光素酶基因转染的PANC-1肿瘤组织发出的生物发光，以监测原位肿瘤的生长情况。在接下来的观察期间，对照组小鼠肿瘤组织荧光信号逐渐增强。
而Lip-DTI/NO + 808 nm激光预照射组的肿瘤组织在治疗后荧光强度较弱，显示出良好的肿瘤生长抑制效果。治疗结束后，将所有小鼠安乐死，取肿瘤照相并称重。Lip-DTI/NO加808 nm激光预照射组对肿瘤生长的抑制作用最为显著。PBS单独、PBS + 808 nm激光预照射、Lip-DTI单独、Lip-DTI + 808 nm激光预照射、Lip-DTI/NO单独和Lip-DTI/NO + 808 nm激光预照射小鼠解剖肿瘤的平均重量分别为1.05、1.01、0.68、0.62、0.57、0.28 g，说明Lip-DTI/NO对原位胰腺肿瘤生长的抑制作用较好。此外，在整个治疗期间，各组小鼠的体重均略有增加，表明这些脂质体在体内的全身毒性可以忽略不计。
采用免疫荧光染色法检测不同处理后肿瘤组织中I型胶原蛋白水平。对照组肿瘤切片显示出明显的ⅰ型胶原对应的绿色荧光信号，而Lip-DTI/NO + 808 nm激光照射组的绿色荧光信号减少到pbs处理组的17%左右，说明ⅰ型胶原被有效消化，这与基于皮下肿瘤模型的结果一致。采用苏木精伊红(H&E)、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP nick end标记(TUNEL)、Ki67染色等方法对不同处理后肿瘤切片的增殖活性进行组织学和免疫组化研究。对照组(PBS、PBS + 808 nm激光预照射)细胞增殖未见明显变化。而Lip-DTI/NO加808 nm激光预照射组引起肿瘤细胞最严重的凋亡或坏死(见H&E和TUNEL染色)，抑制肿瘤增殖(见Ki67染色)。这些结果有力地证明了Lip-DTI/NO通过ONOO−增强PDT-PTT对富间质癌的显著治疗效果。
结论
总之，我们开发了一种多功能脂质体LipDTI/NO，将多功能AIE活性光敏剂DTITBT与GSH或热反应性NO供体SNAP结合，用于ONOO−诱导的胶原消化和增强光疗。负载的DTITBT分子能够同时生成i型ROS (O2•−)，并具有NIR-II荧光发射和良好的光热转换效率。在808 nm光照射下，在DTITBT和GSH同时生成O2•−或热触发SNAP释放NO的基础上，Lip-DTI/NO可有效诱导肿瘤原位生成高毒性ONOO−。生成的ONOO−被证明可以激活pro-MMP转化为具有催化活性的MMPs，从而可以水解肿瘤ECM中各种类型的胶原，从而促进Lip-DTI/NO在肿瘤中的渗透和积累。在NIR-II窗口下，在皮下和原位胰腺癌模型上验证了Lip-DTI/NO的ONOO−增强PDT-PTT疗效。该研究为探索ONOO−增强的药物传递和治疗富间质恶性肿瘤开辟了新的视角。
参考文献
Photo-Triggered Cascade Therapy: A NIR-II AIE Luminogen Collaborating with Nitric Oxide Facilitates Efficient Collagen Depletion for Boosting Pancreatic Cancer Phototheranostics， Dan Li, Xiaohui Chen, Wenbin Dai, Qiao Jin, Dong Wang,* Jian Ji,* and Ben Zhong Tang* ， Adv. Mater. 2024, 36, 2306476,https://doi.org/10.1002/adma.202306476
