内容提要
细菌感染是公共卫生的主要风险。开发抗细菌感染的发光金属光敏剂引起了生物医学领域的持续关注。最重要的问题是延长金属基光敏剂的吸收和发射波长，以提高体内成像和光疗的效率。为了解决这个问题，我们合理地设计了一种长波发射的钌(II)金属循环(这里称为1)，它具有优越的光学穿透性(~ 7 mm)和令人满意的活性氧生成性能。配合物1对哺乳动物细胞具有广谱抗菌活性和低毒性。此外，1可以对金黄色葡萄球菌感染的小鼠进行高效的体内荧光成像引导光疗，而不良反应可以忽略不计，这表明1可以成为一个很好的病原体光疗平台。钌(Ru)配合物作为潜在发光光敏剂被开发用于癌症和病原体的光诊断和治疗。然而，大多数现有的钌配合物在短激发和发射波长方面作为光敏剂是有限的。在这里，我们提出了一个发光的Ru(II)金属循环(这里称为1)，它由808 nm激光激发，并通过配位驱动的自组装在波长约1,000 nm处发射。metalacycle 1具有良好的光学穿透性(~ 7 mm)和令人满意的活性氧生成性能。此外，1显示出广谱抗菌活性(包括对耐药大肠杆菌)以及对正常哺乳动物细胞的低细胞毒性。体内研究表明，1可用于金黄色葡萄球菌感染小鼠模型的精确、二区近红外生物医学窗口荧光成像引导、光触发治疗。因此，这项工作通过延长超分子光敏剂波长的策略，拓宽了其应用范围。
实验结果与讨论
Ru(II)金属环的合成
以苯基吡啶基团为Ru(II)配位单元，通过分子工程的方法，以优化后的供-受体-供支架为基础，设计了NIR-II荧光配体2。Ru(II)金属环1是通过荧光配体2和Ru(II)受体3的[2+2]配位驱动自组装，在CHCl3/ MeOH中以1:1的混合物搅拌24小时构建的。电喷雾电离时间飞行质谱分析显示出两个主峰，并根据矩形金属循环的形成证实了化学计量学，其中包括与OTf反离子损失一致的完整实体的各种电荷(m/z = 1006.7979 [1 - 3otf]3+和718.1162 [1 - 4otf]4+)电喷雾电离飞行时间质谱谱峰与理论谱图吻合较好。
Ru(II)金属大环的体外光物理性质
1在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中显示出约760 nm处的最大吸收峰(16)。DMF中1的最大发射波长为~ 1,000 nm，位于NIR-II生物窗口内。DMF中1的摩尔吸收系数(ε)和相对量子产率(ΦF)分别为33,300 M-1 cm-2和0.46% 。我们进一步评估了1在生理条件下的稳定性。通过记录其在不同溶液中的吸收光谱来评价其化学稳定性。1在不同pH条件下以及在磷酸盐缓冲盐水和10%胎牛血清中均表现出良好的稳定性。配合物1在连续808 nm激光照射下也具有良好的光稳定性。然后使用商业光敏剂Ru(bpy) 32 +作为对照，在组织模拟物中评估1的光学穿透性。与Ru(bpy) 32 +的荧光信号相比，当穿透深度增加到1 mm时，Ru(bpy) 32 +的荧光信号基本上变得几乎不可见，而当穿透深度增加到7 mm时，1的信号也被区分出来。
体外活性氧的生成及光热性质与抗菌活性
我们使用经典的活性氧(ROS)指示剂20,70 -二氯二氢荧光素(DCFHDA)来评估体外ROS生成能力。在808-nm连续照射下，与1孵育后荧光强度(540 nm)迅速增加。此外，与配体2相比，配合物1的ROS生成增加了近1.7倍。ROS生成的改善可归因于将重原子Ru引入金属循环和促进系统间交叉。此外，在相同条件下，Ru(II)受体3几乎没有产生ROS。这一结果表明，1。我们使用市售的ROS指标来区分由1产生的ROS种类。.用羟基苯基荧光素和二氢霍达明123分别检测羟基自由基(•OH)和超氧阴离子(•O2)的生成。在1存在的情况下，羟基苯基荧光素和二氢膦胺123的荧光强度变化随照射时间的增加而迅速增加，表明有效地生成•OH和•O2。此外，1的能隙(Est)为0.42 eV，进一步表明高效ROS生成的高系统间交叉率。然后通过测量1溶液的温度来确定1的光热特性，在0 ~ 20 μM的浓度范围内，观察到1的温度显著升高。1的光热转换效率(39.0%)高于美国食品和药物管理局批准的荧光染料吲哚菁绿(15.8%)。此外，在加热和自然冷却试验中，发现1具有良好的光热稳定性，没有明显的温度下降。
通过在600 nm处记录光密度，并对不同处理后的细菌琼脂板进行拍照，测定其抑菌活性。选择革兰氏阳性(G+)菌(金黄色葡萄球菌)和肺炎链球菌)和革兰氏阴性(G -)菌(大肠杆菌和耐卡那霉素大肠杆菌)，测定其抑菌活性。1显示出对这四种细菌的剂量依赖性抗菌活性，包括耐药大肠杆菌。另外，808 nm激光照射(10 min)对G+菌的杀伤效果优于G -菌。这种抗菌选择性可能是由于G -细菌的细胞壁结构更厚、更复杂。此外，1在正常细胞(即16HBE细胞)中表现出较低的细胞毒性，这表明1基光敏剂在抗菌应用中具有良好的生物相容性、特异性和选择性。此外，经过1的培养和808 nm激光的进一步照射，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在DCFH-DA染色时显示出增强的绿色荧光，这表明细菌可以有效地产生ROS。
体外细菌成像
我们将金属循环1与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌孵育，以测试其与细菌的相互作用。与1孵育后，在细菌中观察到强烈的NIR-II荧光信号。金黄色葡萄球菌的平均荧光强度几乎是大肠杆菌的2.3倍，这表明金黄色葡萄球菌对1的摄取高于大肠杆菌。采用电感耦合等离子体质谱法定量分析细菌对1的摄取。金黄色葡萄球菌中金属Ru的含量(131.5 ng/mg细胞)高于大肠杆菌(47.2 ng/mg细胞)，与荧光成像结果吻合良好。此外，扫描电镜表征显示，1与激光照射的结合使细菌细胞壁发生不同程度的皱折和扭曲，从而导致细菌死亡(图中红色箭头)。最后，zeta电位的结果表明，细菌与带正电的金属环1结合后，其负电荷减少。
体内细菌成像和抗菌试验
此外，我们通过配制1,2-二硬脂酰- n-甘油-3-磷酸乙醇胺-甲氧基聚乙二醇5000 (DSPE-mPEG5000)制备了含有1的纳米颗粒(NPs) (SI Appendix, Section C)。具有超低细胞毒性的DSPE-mPEG5000可以延长在血液循环中的滞留时间，并在感染部位积累更多，因为聚乙二醇化的NPs可以逃离网状内皮系统。NPs 1的最大吸收和发射波长与1相比没有明显变化。之后，动态光散射结果显示平均水动力直径为~ 240 nm 。通过透射电子显微镜测定，合成的NPs 1表现出高度的单分散性和均匀性，平均粒径为~ 200 nm。NPs为1也显示出良好的尺寸稳定性，在动态光散射研究中，在磷酸盐缓冲盐水和10%胎牛血清中，在7天的过程中，NPs的尺寸分布没有变化。此外，NPs 1在不同条件下表现出化学稳定性、光稳定性和光热稳定性，有利于进一步在体内应用。与1相比，1的NPs也保持了良好的ROS生成能力和光热性能。最后，NPs 1不会引起明显的红细胞溶血，因此具有良好的生物相容性。
随后，我们在小鼠身上建立了金黄色葡萄球菌感染的伤口模型。小鼠模型静脉注射NPs 1。感染创面的荧光信号表明NPs 1已成功积累。注射后24小时，NPs积累量达到最大值，信号背景比为~ 7.5。体外生物分布结果显示，在感染皮肤和脏器(包括肝脏、脾脏和肾脏)中有明显的蓄积，而不是在正常皮肤中，这表明静脉注射后在伤口区域有特异性蓄积。然后选择注射后24小时时间作为进行光疗的最佳时间点。在荧光成像的指导下，我们评估了光触发处理的效果。记录了6 d内不同时间点创面愈合过程的宏观外观，NPs为1并进行激光光照射的小鼠愈合速度快，而对照组创面几乎没有恢复。小鼠的体重几乎没有变化，苏木精和伊红染色结果证实没有明显的不良反应，组织学毒性可以忽略不计。感染皮肤切片的苏木精和伊红染色进一步支持了1 nm和808 nm激光光照NPs联合使用对感染创面愈合效果的改善。
总结
我们成功构建了发射波长超过~ 1,000 nm的Ru (II)金属环1。Metallacycle 1具有优异的光学穿透性(~ 7 mm)和有效的抗菌能力。此外，1还显示出广谱抗菌活性和对哺乳动物细胞的低毒性。在NPs中制备后，利用NIR-II荧光成像引导光诱导对金黄色葡萄球菌感染小鼠进行精确的细菌诊断和有效的光疗。在这项研究中，我们开发了一种有效的策略来构建用于诊断和治疗的长波吸收和发射SCCs。
参考文献
Long wavelength–emissive Ru(II) metallacycle–based photosensitizer assisting in vivo bacterial diagnosis and antibacterial treatment , Yuling Xu, Chonglu Li, Xin Ma, Wei Tuo , Le Tu , Xiaopeng Li , Yan Sun, Peter J. Stang, and Yao Sun,PNAS 2022 Vol. 119 No. 32 e2209904119 https://doi.org/10.1073/pnas.2209904119
