行业文献

内容提要

   开发I型光敏剂为解决传统II型光动力治疗(PDT)固有耗氧和肿瘤微环境缺氧所导致的光动力治疗(PDT)疗效不足提供了一条有效的途径。探索I型PS面临的挑战是促进光敏分子将氧或H₂O转化为活性氧(ROS)的电子转移能力。我们提出了一种电子受体触发的光诱导电子转移(a- PET)策略，通过非富勒烯支架光敏剂和苝二亚胺的两个有机半导体分子的结合，促进电子空穴对的分离，显著促进I型PDT途径产生大量的ROS，诱导3.5倍和2.5倍的羟基(OH^.)和超氧化物(O₂^-.)的产生。通过理论计算和超快飞秒瞬态吸收(fs-TA)光谱分析揭示了光辐射后分子间的电子转移和分子内的电荷分离产生了促进I型PDT过程的自由基离子对。通过光声成像和近红外II区荧光成像，该制备的纳米平台在缺氧条件下表现出优良的光细胞毒性，并在小鼠中表现出出色的抗肿瘤效果。

实验结果与结论

4F-PDI NPs的制备与表征

   我们设计了两个有机半导体分子PDI和4F作为构建块来形成组装的PS。该PDI分子在四氢呋喃(THF)溶液中表现出典型的近红外吸收和发射，峰分别在685 nm和729 nm处。将两个2-(5,6二氟-3-氧-2,3-二氢- 1h -吲哚-1-乙基)丙二腈连接到电子给体单元的两端，得到更大的共轭体系，得到黑色蓝色产物4F。由于骨架高度共轭，电子离域增强，4F在四氢呋喃(THF)溶液中的光吸收/发射峰分别在708 nm和779 nm处显示出强大的光学能力。考虑到所得分子的疏水性，用两亲性聚合物F-127对这两个有机半导体分子进行包裹提供水分散和生物相容性。采用纳米共沉淀法将4F和PDI以不同的混合物(摩尔比为1:0、1:1、1:1、1:2、1:4和1:1)制备了4F-PDI纳米粒子。PDI表面颜色由蓝色变为绿色，在635 nm处吸光度增加，表明PDI和4F包封成功。这两种有机发色团4F NPs和PDI NPs在水溶液中表现出很强的近红外吸收，在784 nm和635 nm处的摩尔吸收系数分别为1.68×105 m^-1 cm^-1和1.66×104 m^-1 cm^-1。所制备的纳米平台在近红外窗口具有良好的光利用能力，为深层组织的生物应用提供了巨大的优势。动态光散射(DLS)测试和透射电子显微镜(TEM)图像显示，4F-PDI NPs呈均匀球形，平均纳米直径约为80 nm。进一步评估了纳米系统的光学效能。含水的4F-PDI NPs分别在784 nm和987 nm处有吸收峰和发射峰。在1000 nm LP滤光片下采集纳米平台的NIR-II荧光图像。4F-PDI NPs具有明亮的NIR-II荧光对比度。由于良好的近红外吸收，进一步研究了4F-PDI NPs的体外PAI能力。采集了不同激发波长下的PA光谱。结果表明，4F-PDIx的PA信号与其吸收光谱匹配良好。我们使用784 nm的光照射来记录NPs的PA图像，主要是由于PA信号峰值和组织穿透深度的合理平衡。结果表明，NPs具有明显的PA信号，且PA强度与样品含量呈线性相关。4F-PDI NPs可以作为PA/NIR-II显像剂，用于深度组织和高分辨率的精确生物成像。

4F-PDI纳米粒子 ROS产生

   考虑到所制备的NPS具有优异的光学性能，利用808 nm激光(100 mWcm^-2)对其光动力学特性进行了研究。本文利用相同4F含量的4F-PDIx (4F NPs、4FPDI0.5 NPs、4F-PDI1 NPs、4F-PDI2 NPs和4F-PDI4 NPs实验探索其ROS生成能力。非发光的ROS敏感型二氯二氢荧光素(DCFH)作为生成指示剂，经ROS培养后可转变为绿色发光的2′，7′-二氯荧光素(DCF)。通过记录光照射后DCF的525 nm发射变化来评估ROS的产生。随着4F-PDIx NPS中PDI比例的增加，ROS的生成量与单独4F NPS相比显著增加。4F-PDI1 NPS的ROS生成比4F NPS增加了3.3倍以上。当4F与PDI的摩尔比增加到1:1时，4F-PDIx生成ROS的能力达到最大平衡。因此，这些结果表明这些4F-PDIx NPS在光照射后可以快速产生ROS。我们利用OH^.特异性探针氨基苯基荧光素(APF)来鉴定ROS的产生效率。4F NPs表现出中等的OH^.生成能力，而添加PDI可显著促进OH^.的生成，比4F NPS增加3.5倍以上。通过记录不同光照射时间下O₂^-.敏感二氢膦胺123 (DHR123)的荧光变化，进一步研究O₂^-.的产生。随着4F-PDIx NPS中PDI含量的增加，O₂^-.的生成量比单独的4F NPs显著增加2.5倍以上。特别是当4F与PDI的摩尔比增加到1:1时，4F-PDIx生成O₂^-.的能力几乎达到平衡阶段。利用¹O₂特异性荧光检测器单线态氧传感器绿色(SOSG)来评估¹O₂的生成。4F NPS表现出相对突出的¹O₂生成能力，而引入PDI后没有改善额外的¹O₂释放。因此,我们可以得出以下结论:在808 nm激光照射下，PDI的引入可以促进自由基的产生。随着NPS中PDI含量的增加，4F-PDIx的ROS生成能力增强。当4F与PDI的摩尔比增加到1:1时，4F-PDIx生成ROS的能力达到最大平衡。因此，4F-PDI1 NPs被用于探索进一步的治疗应用。作为对比，在660 nm激光照射下进行了相同的实验。结果表明，4F-PDI的ROS生成量小于4F和PDI的总和，证明在660 nm照射下，PDI的引入不能促进4F的ROS生成。上述结果表明4F-PDI1 NPs通过I型和II型光化学途径具有显著的ROS生成效率。

   为了深入研究4F-PDI1 NPS的耐缺氧PDT效率，我们利用ROS指示剂DCFH、OH^.特异性检测器APF、捕集剂DHR123和¹O₂敏感探针SOSG来研究常氧和缺氧条件下的ROS生成能力。通过引入连续氩气气流模拟了缺氧条件。在常氧或缺氧环境下，4F-PDI1 NPS都能产生大量ROS。特别是NPs诱导OH^.的生成不依赖于氧含量，这赋予了耐缺氧的I型PSs在高效肿瘤PDT治疗中的卓越优势。4F-PDI1 NPS在常压环境下可以产生O₂^-.和¹O₂，而在缺氧条件下产生效果不理想。因此， 4FPDI1 NPs可以在复杂的肿瘤微环境下作为高效的耐缺氧PS治疗肿瘤。

放大I型光动力路径的光化学机制

    在缺氧和常氧环境下I型PDT (OH^.和O₂^-.的产生)的机制。首先，光照射将受体4F激发到激发态，生成的活性4F将电子转移到分子氧上，生成O₂^-.。同时，电子给体PDI很容易将电子转移到被激发的4F上。形成的阳离子自由基(A^+.)立即从周围的水中捕获电子，氧化水分子释放OH^.。同时，在Type-II过程中，处于三重态激发态的4F可以进一步向周围的O₂传递能量，生成¹O₂。此外，S₁和最近的T₂之间极低的能隙(ΔEST)有利于光敏化体系的ISC过程。我们进一步通过fs-TA谱分析了4F NPs和4F-PDI1 NPs的超快激发态动力学行为。结合稳态光学吸收光谱，利用808 nm的光辐射具有足够的能量将4F和4F-PDI1的基态(S₀)填充到第一激发态(S₁)。4F和4FPDI1在600 ~ 800 nm范围内均表现出明显的负吸收带，与稳态光学吸收光谱完全一致，属于基态漂白。从二维伪彩色fs-TA光谱可以看出，4F-PDI1 NPs的基态漂白信号衰减相对较快。通过提取不同延迟时间下的瞬态吸收光谱，4F-PDI1 NPs的基态漂白信号也比4F NPS衰减得更快。鉴于这些材料的非重叠稳态光谱， 4F和PDI之间没有荧光共振能量转移。我们得出结论，在超快光谱中观察到的过程是分子间电子转移。在660 nm激光照射下进行了同样的实验探索。4F和4F-PDI1 NPs基态漂白信号呈现相对平行的衰减，证明在660 nm辐照下，PDI的引入几乎不会改变4F的光物理性质。我们可以得出结论，ROS的放大过程不是由之前报道的d-PET引起的。根据上述结果，808 nm激光照射下4F-PDI1 NPs内更快的电子转移过程进一步放大了ROS的产生效率，特别是通过aPET策略促进了I型PDT路径。

细胞实验

   在4F-PDI1 NPs出色的光动力学效应的激励下，我们通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)研究了4T1细胞的PDT活性。我们首先使用商业荧光探针记录了常氧(21% O₂)和缺氧(2% O₂))条件下细胞内ROS的产生。DCFH-DA(2,7-二氯二氢荧光素二醋酸酯)测定总ROS评价。在808 nm照射下，DCFH-DA培养的细胞内可以清晰地观察到明亮的绿色荧光信号，说明4F-PDI1 NPS在光照射后产生了大量的ROS。相比之下，4F NPS处理DCFH-DA的绿色荧光信号相对较弱，表明与4F-PDI1 NPS相比，ROS生成效率较低。此外，在缺氧环境下，4F-PDI1 NPS和4F NPS的绿色荧光都比常氧条件下弱。随后，用HPF(羟基苯基荧光素)荧光探针检测纳米药物激活的细胞内OH^.生成。图像显示，在缺氧和常氧条件下，经过4F-PDI1 NPS处理的4T1细胞在光照射后都观察到强烈的荧光信号，证明了这种NPS强大的OH^.生成。为了直接可见地揭示4F-PDI1 NPS惊人的癌细胞杀伤能力，设计并进行了活/死细胞染色实验分析。利用钙黄素AM/碘化丙啶(PI)试剂盒对4F-PDI1 NPS在4T1细胞系上的光毒性进行可视化观察。其中，死细胞用PI染色可发出红色荧光信号，活细胞用Calcein AM染色可发出绿色荧光。如图所示，4F-PDI1 NPS比4F NPS表现出更明显的光毒性。在去除光照射后，4F-PDI1 NPS和4F NPS处理的4T1细胞仅在绿色通道中显示荧光信号，没有明显的细胞毒性。接下来，通过细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)测定，定量测定4FPDI1 NPS的细胞毒性。结果表明，在常氧和缺氧环境下，4F-PDI1 NPS和4F NPS在没有光照射的情况下表现出可忽略不计的细胞毒性。在808 nm, 100 mWcm ²光照射10 min后，4F-PDI1 NPS和4F NPS对4T1细胞株均有明显的细胞死亡，常氧条件下4F-PDI1 NPS的半抑制浓度(IC50)小于10 μM，缺氧条件下<15 μM。特别是，降低氧分压对4F-PDI1 NPS处理组细胞死亡无明显影响，进一步证明4FPDI1 NPS具有强大的耐缺氧i型光动力效应。随后，Annexin V-FITC/PI凋亡细胞检测试剂盒用于缺氧环境下PDT过程中细胞凋亡的研究。4F-PDI1 NPS与光照射后细胞死亡率明显升高。相比之下，NPS单独处理或光辐射处理后，检测到大量活细胞，表明这种定制纳米剂具有出色的细胞相容性。此外，体外血液相容性实验表明，该制备的纳米平台具有良好的血液相容性，进一步证明了其在后续生物实践中的强大优势。这些结果表明，4F-PDI1 NPS可作为一种可靠、高效的活体小鼠氧不依赖型PDT的PS。相比之下，在相同条件下，4F NPS产生的OH*明显更少。此外，利用DHE(二氢乙锭)和SOSG可视化4T1细胞中O₂^-.和¹O₂的释放。结果表明，PDI的引入使O₂^-.的生成增加，但对¹O₂的生成没有影响，这与上述水溶液中的实验结果吻合。

体内多模态成像、药代动力学和抗肿瘤疗效评价

   为了寻找PDT的最佳时间窗，我们将4F-PDI1 NPs (100 μM, 150 μL)静脉注射到4T1瘤小鼠体内，并通过PAI和NIR-II成像监测其迁移和肿瘤积累。将荷瘤小鼠固定在NIR-II型荧光扫描仪中，该扫描仪配备4个808 nm激光器，均匀提供激发能。注射后5分钟，4F-PDI1 NPS能够可视化动态血管流动，并清晰地绘制血管图，与周围组织有明显的分界。随着注射时间的延长，在肿瘤区域逐渐观察到明亮的NIR-II荧光信号，表明纳米药物的有效积累，从而通过NIRII荧光成像使肿瘤组织变亮。结果显示，注射4FPDI1 NPs后12 h，肿瘤部位内NIR-II荧光强度达到亮度峰值。纳米药物的显著积累增强可能归因于增强的渗透和保留效应，诱导肿瘤部位的血管舒张。随后，肿瘤组织的NIR-II荧光亮度逐渐降低，24 h注射时间点荧光强度相对于12 h较弱，这归因于生理环境中的代谢清除。此外，定量荧光信号进一步使NPS的迁移可视化。然后，我们继续研究注射后4F-PDI1 NPS的生物分布。取注射纳米制剂的荷瘤小鼠的主要脏器和肿瘤，进行离体NIR-II荧光成像。肝脏、脾脏和肿瘤的NIR-II荧光强度高于心脏、肺和肾脏，表明4F-PDI1 NPS主要通过肝胆途径被清除和代谢。PAI与NIR-II成像结果相同，注射后12 h肿瘤PA信号最大值为4.19 ~ 0.37。因此，基于上述生物成像结果，为了进一步的治疗研究，我们选择注射后12 h的时间点应用PDT，以获得最大的疗效。为了进一步评估量身定制的纳米材料的生物药代动力学，我们给4T1肿瘤小鼠静脉注射4F-PDI1 NPS，小鼠采集血液的NIR-II荧光信号显示4F-PDI1 NPS的血液循环时间较长，这突出了纳米平台在肿瘤部位的良好蓄积作用。这些结果表明4F-PDI1 NPS具有良好的PA/NIR-II成像能力和用于肿瘤精确光疗的深部组织生物学可行性。

   我们进一步通过皮下4T1肿瘤模型来研究4FPDI1 NPS的PDT治疗效果。小鼠静脉注射4FPDI1 NPS (100 μM, 150 μL)，注射后12 h，肿瘤部位照射(808 nm, 100 mWcm 2) 10 min。以PBS+激光、4FPDI、PDI+激光、4F+激光治疗小鼠为对照组。如图所示，在处理过程中，所有处理小鼠的体重都没有明显变化，表明这些纳米平台具有良好的生物相容性。然后，定期监测所有治疗小鼠的肿瘤生长情况。与对照组相比，4F-PDI1 NPS+光照射组有明显的肿瘤生长抑制。值得注意的是，4F NPS+光处理组可以部分抑制肿瘤生长，这是由于4F NPS固有的ROS生成能力。此外，其他治疗组的肿瘤抑制作用不显著。随后，在治疗16天后收集所有治疗小鼠的肿瘤。4F-PDI1 NPS+光照射组的肿瘤大小明显小于其他对照组。这些结果突出了4F-PDI1 NPS在生物实践中出色的PDT能力。通过对光治疗后小鼠肿瘤切片进行末端脱氧核苷酸转移酶dUTP镍端标记(TUNEL)实验和苏木精和伊红(H&E)共染色实验，深入评估治疗效果。与其他四组相比，4F-PDI1 NPS+光处理后肿瘤组织的H&E染色图像中可见明显的细胞凋亡和组织坏死。TUNEL染色结果与H&E染色图像一致。此外，所有小鼠的其他主要器官均未出现明显的凋亡、炎症或组织坏死，进一步证明光辐射和纳米平台在生物实践中的生物毒性可以忽略不计。

结论

   我们提出了一种引人注目的分子间电子转移相互作用策略，通过在单个纳米颗粒中混合两个有机半导体分子来放大不依赖氧的I型光动力肿瘤治疗。由NIR-II发光的A- D - A型支架4F和广泛使用的光电分子PDI通过非共价功能化组装而成的光疗剂(4F-PDI1 NPS)。4F-PDI1 NPs可以在不依赖氧的环境下高效地产生ROS。PDI可以作为电子加速器促进4F光敏后的分子间电子转移和分子内电荷分离，形成自由基离子对，放大I型光敏过程。此外，定制的纳米平台能够发射NIR-II荧光和PA信号。体外实验表明，这种制备的NPs在恶劣的缺氧条件和常氧环境下都表现出极好的光细胞毒性。体内研究表明，该纳米制剂可实现高分辨率和超低背景NIR-II荧光和PA成像。进一步的生物学试验表明，4F-PDI1 NPs对肿瘤部位表现出明显的细胞毒性，导致明显的实体瘤抑制。这一贡献将为开发新一代耐缺氧PSs用于肿瘤治疗提供新的见解。

参考文献

Deciphering Oxygen-Independent Augmented Photodynamic Oncotherapy by Facilitating the Separation of Electron-Hole Pairs，Xiaoming Hu, Zhuting Fang, Fengwei Sun, Caijun Zhu, Mingxuan Jia, Xiaofei Miao, Lingting Huang, Wenbo Hu,* Quli Fan,* Zhen Yang,* and Wei Huang*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202401036， http://doi.org/10.1002/anie.202401036