内容提要
半导体聚合物纳米粒子(SPNs)在二次近红外窗(NIR-II)光疗中具有广阔的应用前景。然而，代谢时间长的问题严重限制了SPNs的临床应用。在本研究中，我们合理设计了一种生物可降解的SPN (BSPN50)，用于NIR-II荧光成像引导光动力治疗(PDT)。BSPN50是用两亲共聚物F-127包封可生物降解的SP (BSP50)制备的。BSP50由NIR-II荧光二酮吡咯(DPP)段和可降解聚苯乙烯(PPV)段按50/50的比例组成。BSPN50在髓过氧化物酶(MPO)/过氧化氢(H2O2)下具有良好的降解性，在808 nm激光激发下具有NIR-II荧光发射。在808 nm激光照射下，BSPN50表现出良好的光动力效应。BSPN50在体外和体内的降解速度均快于不含PPV片段的BSPN100。此外，BSPN50可以通过NIR-II荧光成像有效诊断肿瘤，并通过PDT抑制肿瘤生长。因此，本研究为构建生物可降解的肿瘤NIR-II光疗纳米平台提供了一种合理的途径。
结果和讨论
BSP由3，6-双（5-溴噻吩-2-基）-2，5-双（2-乙基己基）吡咯[3，4-c]吡咯-1，4（2H，5H）-二酮（化合物1），反式-1，2-双（三丁基锡基）乙烯（化合物2）和1，4-二溴-2，5-双（2-乙基己基）氧基苯（化合物3）通过钯催化静默聚合合成。BSP是由DPP和PPV段组成的随机嵌段共聚物。为了研究DPP和PPV区段比对NIR-II荧光信号性质和降解性的影响，合成了DPP区段比为25%，50%，75%和100%的四个BSP，分别命名为BSP25，BSP50，BSP75和BSP100。质子核磁共振（1H NMR）谱证实了它们的结构。9.05，4.15和4.08 ppm的共振峰分别归因于噻吩环上的质子，氧和氮附近的亚甲基上的质子。从BSP25到BSP100，9.05和4.08 ppm的峰值强度与4.15 ppm的强度相比逐渐增加。这一现象表明，当9.1和4.1 ppm的峰值被分配到来自DPP的质子时，DPP区段的比率从BSP25逐渐增加到BSP100。BSP的分子量用GPC表征，结果可在表S1中找到。所有BSP具有相似的分子量，高于100,000 g/mol，且具有相对低的多分散度(PDI)。这些数据证明了BSPs的成功合成。
为了使BSPs具有水溶性和生物相容性，采用两亲性共聚物F-127包封BSPs，通过纳米沉淀法合成BSPN。所有四种纳米粒子溶液都表现出相似的绿色DLS显示BSPN25，BSPN50，BSPN75和BSPN100纳米粒子在40-70 nm范围内具有相似的尺寸分布，平均直径分别计算为54.26±2.23，50.91±2.46，58.22±1.97和58.31±1.88 nm。TEM图像显示了所有BSPN的球形形态。研究了BSPN的光学特性。对于所有的BSP，观察到浓度和吸收之间的线性关系，显示了定量研究的可行性。BSPN50、BSPN75和BSPN100在700~800nm均表现出强吸收峰，且强度随DPP段的增大而增大。相反，该区域的吸收对于BSPN25要弱得多，这可以归因于BSPN25的DPP段的低比率。所有的BSPN都显示了NIR-II荧光信号，最大发射在1000纳米左右。BSPN75和BSPN100具有几乎相同的NIR-II荧光强度，其次是BSPN50和BSPN25。与NIR-II荧光信号的结果相似，BSPN在808 nm处的PA强度从BSPN25增加到BSPN100。这些数据表明，具有较高DPP段比的BSPN在NIR区具有较高的吸收和更强的NIR-II荧光和PA强度。
然后研究了BSPN的可降解性。HClO是一种广泛存在于生物体中的氧化物质，被选择与BSPNs孵育。孵育30分钟后，所有BSPN的吸收在一定范围内减少。在所有BSPNs中，BSPN25的下降率最高（51.23%），其次是BSPN50（40.47%），BSPN75（26.89%）和BSPN100（24.45%）。BSPN还表现出增加HClO时PA振幅减小，以及随着PPV段比的增加而增强的减小速率。这些结果表明，HClO可以使BSPN降解，并且随着PPV段比的增加，降解速度加快。还测试了不同浓度HClO下BSPN的NIR-II荧光强度。与吸收和PA强度的变化不同，NIR-II荧光信号在HClO低浓度下首先增加，然后随着HClO浓度的进一步增加而降低。荧光信号的增加可能归因于BSPs主干中噻吩的氧化。由于NIR-II荧光信号的变化不能很好地反映BSPN的降解，因此它没有被用作监测降解的指标之一。GPC数据也验证了这样的结论。对于BSPN25和BSPN50，大部分高分子量样品在降解后转移到低分子量的片段中，而对于BSPN75和BSPN100，大量样品仍保留高分子量。降解后BSP25和BSP50的平均数-平均分子量(Mn)也低于BSP75和BSP100。由于低分子量片段的产生，BSPN在525纳米处的荧光发射在降解过程中逐渐升高。与BSPN25和BSPN50相比，BSPN75和BSPN100在525 nm处的荧光仅显示出较低的升高。HClO处理后，BSPN25和BSPN50的荧光强度分别是BSPN100的8.76和6.92倍。这些数据表明BSPN25和BSPN50的降解性都很好，而BSPN75和BSPN100的降解性相对较差。DLS也证实了BSPN50的降解。与HClO孵育后，出现了少量的大纳米粒子，这可归因于降解段的聚集。由于BSPN25的NIR-II荧光强度太低，因此选择了NIR-II荧光信号和降解性都令人满意的BSPN50进行进一步研究。
为了模拟体内微环境，MPO和H2O2与BSPN50共孵育，以证实其在NaCl存在下的生物降解性。525 nm处的荧光强度随孵育时间逐渐升高，48h处的强度比孵育前高17.8倍。对于BSPN100，相同处理下的荧光增强（6.8-倍）比BSPN50弱得多。对于BSPN50和BSPN100，仅用H2O2处理时荧光信号没有明显增强。这些结果表明，BSPN50在体内模拟环境中也可能降解。然后评估BSPN50的光疗能力，并以DPBF作为1O2指示剂。808 nm激光辐照10分钟后，417 nm处的吸收显著下降，这表明1O2的有效生成。然而，在降解后，BSPN50的1O2生成显著减少，这可能归因于BSP50主干的降解和近红外吸收的减少。BSPN50在808纳米激光辐照下仅表现出微弱的光热效应。BSPN50在长期储存下也表现出良好的稳定性以及在长期辐照下的光稳定性。BSPN50具有令人满意的生物降解性，NIR-II荧光成像，1O2生成能力和高稳定性，被选为进一步体外和体内研究的候选。
然后研究BSPN50的细胞摄取，选择4T1肿瘤细胞作为模型。由于BSPN50的发射波长太长，共焦荧光显微镜无法检测到，因此在BSPN50中掺杂FITC，使BSPN50-FITC具有较强的绿色荧光。孵育BSPN50-FITC 4h后，在细胞的细胞质中检测到明显的绿色荧光信号，而在PBS处理组中没有检测到绿色荧光信号，表明BSPN50-FITC有效地内化到细胞中。流式细胞术分析证实了BSPN50-FITC由4T1细胞内化。用MTT法评价BSPN50的细胞毒性。与BSPN50孵育12h后，即使在128微克/毫升的浓度下，细胞活力仍保持在95%以上。此外，BSPN50对成纤维细胞NIH-3T3细胞无细胞毒性，表明BSPN50具有良好的生物相容性。相反，对于在808 nm激光辐照下的细胞，随着BSPN50浓度的增加，活力降低，在最高浓度下，活力降低到13.6%。活/死试验和流式细胞术进一步证实了BSPN50在激光辐照下的体外抗癌疗效。为了研究BSPN50抗癌作用的机制，以2，7-二氯荧光素二醋酸酯（DCFH-DA）为指标，对激光辐照下细胞内1O2的产生进行了评价。在808纳米激光辐照之前，几乎无法检测到绿色荧光。辐照3分钟后，在细胞的细胞质中观察到强烈的绿色荧光，表明细胞内1O2的生成。这些结果表明BSPN50具有良好的生物相容性，可能通过细胞内1O2的产生杀死激光辐照下的癌细胞。在RAW264.7细胞中估计了BSPN50的生物降解性。LPS用于刺激M0型RAW264.7细胞分化为M1型，并伴有MPO表达。MTT测定表明BSPN50对RAW264.7细胞具有良好的生物相容性。基于以上结果，BSPNs在降解过程中绿色荧光信号升高。因此，BSPN50在RAW264.7细胞内的降解过程可以用其绿色荧光信号来监测。BSPN50首先与M1型RAW264.7细胞孵育4小时，并且可以有效地内化到细胞中。孵育4小时后，洗涤细胞外的纳米粒子，并随着时间的推移监测细胞内的荧光信号。BSPN50孵育细胞内的绿色荧光信号逐渐增加，24小时的强度是孵育前的2.3倍。相反，对于BSPN100孵育的细胞，强度仅增加1.3-折。这些数据表明BSPN50可以在RAW264.7细胞中有效降解，显示了其在体内的生物降解潜力。
BSPN50随后应用于体内NIR-II荧光成像。在静脉注射之后。注入BSPN50，小鼠的腹血管可以清晰地可视化，显示NIR-II荧光成像的高分辨率。信号背景比(SBR)和半最大全宽度(FWHM)分别根据毛细血管的横断面强度计算为2.97和0.23，这表明NIR-II荧光成像的高质量。然后测试BSPN50用于肿瘤成像的能力，并以4T1承载肿瘤的balb/c小鼠为模型。在静脉注射之前。注入BSPN50，几乎无法检测到荧光信号，显示NIR-II荧光成像的低背景信号。静脉注射BSPN50后，肿瘤区域荧光强度随时间增加。在注射后t=6 h，可以清楚地观察到肿瘤，其荧光强度大约是注射前的4倍。肿瘤区域的最高强度在注射后t=10 h，即使在24小时后强度也能保持在较高水平。此后，小鼠被牺牲，并收集了肿瘤的主要器官进行NIR-II荧光成像。从肝脏，脾脏和肿瘤中可以检测到明显的NIR-II荧光信号，肿瘤的强度与脾脏几乎相同。这些结果表明BSPN50可以有效地积聚到肿瘤部位并应用NIR-II荧光肿瘤成像。
BSPN50以4T1异种移植的小鼠为模型应用于体内PDT。在PBS或BSPN50（600 µg/mL，200 µL）治疗下，分别在808 nm激光辐照（0.5 W/cm2，10分钟）下，将荷瘤小鼠随机分为四组，每组有五个小鼠。对于有或无激光的PBS治疗组和没有激光辐照的BSPN50治疗组，肿瘤体积随时间快速增加，这表明激光辐照和BSPN50都不能仅抑制肿瘤的生长。相比之下，激光组对BSPN50的肿瘤生长有明显的抑制作用，其抑制率为98.3%。治疗后，激光组BSPN50的两只小鼠肿瘤完全消融，显示BSPN50具有优越的PDT效率。所有小鼠的体重在整个处理过程中没有明显的波动，表明BSPN50介导的PDT的生物安全。PCNA染色被引导进一步评估BSPN50在细胞水平上的抗癌效率。对于PBS治疗组，超过90%的肿瘤细胞在治疗后保留了生殖能力。激光和BSPN50组PBS的生存率与PBS组相似。相比之下，激光组BSPN50的生存率显著降低至15.3%，证实了其良好的PDT效率。此外，采用H&E染色法评价BSPN50激光组对小鼠主要器官的损伤。结果表明，在主要器官中没有检测到明显的组织病理学损伤，这表明了这种处理的生物安全。由于NIR-II荧光信号的变化不能很好地反映BSPN的降解，PA成像被引导来评估BSPN50的体内生物降解性。由于肝脏是主要的代谢器官之一，肝脏区域的PA强度衰减被确定为估计纳米粒子的衰减。在静脉注射之前。注射BSPN50或BSPN100，肝脏仅表现出弱PA强度。静脉注射BSPN50或BSPN100后，随着时间的推移，肝区PA强度逐渐增加，BSPN50和BSPN100注射小鼠在t=36h达到最大值。随后，肝区的PA信号随着时间的推移而降低。监测10天后，经BSPN100处理的小鼠肝脏的PA强度降至最大强度的48.2%，而BSPN50的这种比率仅为19.5%。说明BSPN50的代谢速率比BSPN100快。这一结果可能归因于BSPN50比BSPN100的PPV片段比高，这导致BSPN50的新陈代谢更快。
结论
总之，我们开发了一系列用于癌症光疗学的NIR-II荧光BSPN。用两亲性共聚物F-127包封BSPN制备BSPN。BSP由可生物降解的PPV段和具有不同比率的NIR-II荧光DPP段组成。在HClO的降解下，BSPNs在525 nm附近显示出吸收和PA强度的降低以及荧光发射的提高。其中，由50%PPV段和50%DPP段组成的成型纳米粒子（BSPN50）表现出对NIR-II荧光信号和生物降解性的满意。在体内模拟环境（MPO和H2O2）下，BSPN50也表现出良好的生物降解性。此外，BSPN50在808纳米激光辐照下具有良好的光动力效率。体外研究表明，BSPN50在激光辐照下能有效地杀死4T1细胞，并在RAW264.7细胞内降解。BSPN50可用作肿瘤成像和治疗的NIR-II光疗剂，并显示出比其对应的BSPN100更快的代谢过程。我们的研究为开发可生物降解的NIR-II荧光SPN提供了一个合理的途径。除DPP段外，苯并双硫二唑(BBT)和噻二唑洛苯并三唑(TBZ)等其他电子受体段可用作与PPV段合并的替代品，用于开发具有较长吸收和发射波长的BSPN。此外，抗癌药物或抑制剂可以加载到BSPN中，以进一步提高它们的治疗效果。
参考文献
Rational design of biodegradable semiconducting polymer nanoparticles for NIR-II fluorescence imaging-guided photodynamic therapy，Xuxuan Gu, Jinlong Shen, Zhiwei Xu, Wenqi Wang, Ying Wu, Wen Zhou, Chen Xie , and Quli Fan ，Nano Res.，https://doi.org/10.1007/s12274-024-6434-7
