内容提要
本文提出了一种光诱导歧化法制备一型光动力试剂的方法，合理设计并制备了基于bodipyp的光敏剂。光诱导同型发色团之间的分子间电子转移导致歧化反应，导致带电中间体、阳离子和阴离子自由基的形成。阳离子自由基有效地氧化细胞中重要的辅酶——四氢生物蝶呤(BH4)，而阴离子自由基将电子转移到氧上，产生超氧自由基(O2－·)。一类光动力剂不仅能在水中自组装，而且能有效地靶向内质网。在高氧环境(2% O2)下也表现出良好的光细胞毒性，半数最大抑制浓度(IC50)为0.96 μM，在HeLa肿瘤小鼠模型中表现出良好的抗肿瘤作用。
实验结果与结论
分子设计
分子设计包括几个关键步骤来调整它们的性质。首先，通过Sonogashira偶联反应将炔基吡啶引入BODIPY核心的2,6个位置，扩大共轭结构，调节分子的组装(化合物1)。然后，通过亲核取代反应在BODIPY核心的3,5个位置添加正丁胺取代基，调节其光物理性质和氧化还原电位(化合物2)。一个或两个三甘醇(TEG)臂通过亲核反应附着在光敏剂上，使其能够在水环境中自组装形成稳定的组装体(化合物3和4)。
光谱性质和ROS的产生
我们首先测量了DMF中化合物1和2的吸收光谱和荧光光谱。在引入正丁胺后，染料分子的光谱发生了显著的红移。此外，我们还研究了化合物2在不同极性溶剂中的吸收光谱和荧光光谱。在这些溶剂中，化合物2的光谱几乎保持一致，这表明化合物2表现为局部激发分子，具有有限的溶剂化效应。此外，化合物2在各种溶剂中表现出较高的摩尔消光系数，表明其具有很强的光吸收能力。化合物2的包封成聚合物胶束，提供纳米光动力剂，减少染料分子之间的距离，促进有效的光诱导分子间电子转移。
为了验证我们的设计，我们使用商业ROS指示剂2 '，7 ' -二氯二氢荧光素(DCFH)和二氢己胺123 (DHR 123)来研究ROS的生成能力。光照后，DCFH或DHR 123溶液中存在化合物2 NPs时，其荧光明显增强，说明化合物2 NPs能高效生成ROS)。相反，在相同条件下，化合物1 NPs的水分散体中没有检测到ROS，这表明正丁胺取代基是ROS生成所必需的。然后，为了确定生成的ROS类型，我们采用9,10-蒽二基双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)和二氢乙二酸(DHE)分别作为单线态氧(1O2)和超氧自由基的特异性指标。在化合物1 NPs存在的ABDA溶液中，光照射4分钟，吸光度变化可以忽略不计，表明没有产生1个O2)。另一方面，光照下化合物2 NPs存在时，DHE荧光明显增强，表明O2－·生成。为了进一步确认O2－·的产生，我们采用电子自旋共振(ESR)光谱，以5-叔丁基羰基5-甲基-1-吡咯啉n-氧化物(BMPO)作为自旋诱捕剂。含有化合物2 NPs和BMPO的溶液在光照射下的ESR谱显示出与O2－·信号匹配的顺磁加合物特征，表明O2－·的产生。当化合物2溶解于DMF中时，光照射下未检测到ROS，说明化合物2仅以聚集态生成ROS，未以单体态生成ROS。
四氢生物蝶呤的光氧化作用
一型PPs能够在低氧浓度下工作的一个关键解释是，它们能够产生ROS，同时从生物底物中捕获电子。这种双重功能促进了生物底物的氧化。在将电子转移到氧气的过程中，光敏剂必须从邻近的衬底捕获电子以维持其自身的电化学平衡。四氢生物蝶呤(Tetrahydrobiopterin, BH4)是一种不可缺少的细胞内辅酶，在生物体中起着关键的调节作用，参与多种生物过程，包括氨基酸代谢、DNA和RNA合成等。BH4的快速氧化会显著影响肿瘤细胞的代谢，最终导致细胞死亡。BH4易受自由基引起的氧化损伤，导致300 nm左右吸收减少，280 nm吸收增加。将含有化合物2 NPs的BH4溶液暴露于光照射后，BH4在300 nm处的特征吸收峰减弱，而在280 nm处的特征吸收峰增加。这一观察结果表明，化合物2 NPs从BH4中捕获电子，从而诱导BH4氧化。HRMS在240.1083处出现峰值，赋值为BH2或q-BH2的[M+H]+。值得注意的是，化合物1 NPs对BH4的氧化作用可以忽略不计，这进一步强调了正丁胺取代基不可或缺的作用。此外，当化合物2溶解在DMF中时，光照射下未检测到BH4氧化，这表明BH4氧化必需聚集。
机制研究
根据我们的观察，我们推断电子转移发生在同型染料分子之间，导致光诱导歧化机制氧化四氢生物蝶呤并产生O2－·。该过程从光照射开始，光照射将光敏剂激发到激发态(PS*)。随后，受激光敏剂(PS*)与附近的基态光敏剂分子(PS)之间发生快速的电子转移，即光诱导歧化反应，生成自由基离子对PS+·和PS－·。PS+·物质通过热反应氧化BH4，恢复到中性状态。而PS－·则进一步将一个电子传递给分子氧，产生超氧阴离子(O2－·)。这种光诱导歧化机制代表了i型PDT的独特途径。其中同型染料分子之间的电子转移促进了i型PDT过程，而不需要外部电子给体或受体。
为了彻底了解化合物1和2的光物理性质的变化，进行了理论计算。利用密度泛函理论(DFT, b3lyp/631G(d,p))计算了化合物1和2的最低未占据分子轨道(LUMO)和最高已占据分子轨道(HOMO)。与化合物1相比，化合物2中引入正丁胺取代基导致HOMO和LUMO能量更高。其中HOMO和LUMO之间的能隙减小尤为显著，导致化合物2的吸收和发射光谱发生红移。
为了验证所提出的机制，我们进行了一系列的电化学研究。循环伏安实验表明，化合物2的氧化电位(Eox)和还原电位(Ered)分别为+0.100 V和1.154 V (vs. Fc/Fc+)。光诱导电子转移的吉布斯自由能(ΔG)是通过结合氧化还原电位和光敏剂的激发能来估计的。利用Rehm-Weller方程，我们确定了电子转移ΔG为60.8 kJmol-1，表明光诱导分子间电子转移的热力学可行性。相比之下，化合物1在可检测范围内未观察到氧化信号，在其3,5位缺乏正丁胺取代基，表明难以被氧化。因此，光诱导歧化反应对化合物1不利，与我们的实验结果一致。通过光电流强度和电荷转移电阻对光敏剂化合物1和2的电荷分离能力进行了评价。在相同条件下，化合物2的光电流信号明显强于化合物1，说明在光照射下，化合物2的电荷有效分离。此外，化合物2的电荷转移电阻明显低于化合物1，进一步支持其高效的电荷分离。这些结果提供了令人信服的证据，证明化合物2具有i型反应所需的电子性质和电荷分离能力。
PSs的衍生化
为了进一步获得在水中自发自组装的光敏剂，我们研究了两亲化合物3和4的性质。与溶液中的化合物2相比，它们表现出红移的吸收和荧光光谱。化合物3和4可以自组装成水分散的稳定纳米粒子(化合物3和4纳米粒子)，而无需添加额外的表面活性剂。化合物3或4纳米粒子的水分散表现出强烈的近红外光吸收。平均水动力直径分别为72.84±0.14 nm和96.67±0.18 nm。它们在PBS和完全介质中表现出良好的光稳定性和热稳定性。化合物 3和4 NPs的Zeta电位分别为31.12 mV和53.67 mV。此外，用人血清白蛋白(HSA)作为模型蛋白，通过等温滴定量热法(ITC)检测3种NPs的蛋白亲和力。结果表明，蛋白质与化合物3 NPs相互作用的平衡结合常数Ka为6.33 ±1.42×103 M-1，表明与蛋白质的相互作用较弱。溶血实验表明，这些光敏剂没有引起明显的红细胞溶解，表明它们具有良好的生物相容性。
然后，我们使用DCFH、ABDA和DHE作为ROS探针来表征化合物3和4 NPs对ROS的产生。结果表明化合物3和4 NPs均通过电子转移产生O2－· 。值得注意的是，化合物3 NPs的O2－·生成效率最高，是化合物2 NPs的2倍多。ESR实验进一步检测到超氧自由基和BMPO加合物对应的信号，为O2－·的生成提供了确凿的证据。此外，化合物3和4 NPs都表现出通过光诱导歧化反应氧化BH4的能力。此外，化合物3 NPs的氧化效率最为显著，与观察到的O2－·生成效率趋势一致。
体外PDT
我们利用化合物3和4 NPs研究了它们在细胞内的生物活性，因为它们具有优异的O2－·生成效率和自组装特性。利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和流式细胞术初步研究了HeLa细胞对化合物3和4 NPs的细胞摄取。化合物3 NPs孵育3小时后，细胞内荧光信号达到最大值，说明化合物3 NPs被HeLa细胞成功内化。同样，化合物4 NPs在大约2小时的孵育后被HeLa细胞有效内化。此外，对细胞内化机制的研究表明，化合物3和4 NPs进入HeLa细胞受到内吞抑制剂和低温的阻碍，表明化合物3和4 NPs的摄取主要通过能量依赖的内吞途径发生。此外，另外的亚细胞共定位实验表明，化合物3 NPs有效地在内质网中积累，而化合物4 NPs没有明显的亚细胞定位。
在确认光敏剂(ps)可以被细胞有效内化后，我们继续表征PDT过程中ROS的产生。我们使用总ROS探针(DCFH-DA)和特异性O2－·探针(DHE)来检测常氧(21% O2)和缺氧(2% O2)条件下细胞ROS的生成。化合物3 NPs处理的HeLa细胞，以及探针DCFH-DA或DHE，在常氧和缺氧环境下，光照后探针与ROS反应产生的产物都显示出明显的荧光信号。化合物4 NPs也观察到类似的阳性结果。这一结果表明，即使在缺氧环境下，化合物3 NPs和4 NPs也能有效地产生ROS，突出了它们在常氧和缺氧条件下基于ROS的治疗应用的潜力。
受化合物3和4 NPs在体外有效的BH4氧化和ROS生成的鼓舞，我们开始研究它们的PDT活性。采用BH4- elisa试剂盒检测化合物3 NPs诱导BH4对肿瘤细胞的光氧化作用。在光照射下，细胞内BH4水平随着3nps浓度的增加而降低，而在无光照射时，BH4水平不受影响。采用细胞计数试剂盒kit-8 (CCK-8)测定HeLa细胞的细胞活力。值得注意的是，在没有光照射的情况下，化合物3和4 NPs在常氧或缺氧条件下均表现出可忽略不计的细胞毒性。LED光(660 nm, 40 mW/ cm2)照射10分钟后，化合物3 NPs对HeLa细胞表现出明显的细胞毒性，常氧条件下的半数抑制浓度(IC50)为0.79 μM，缺氧条件下的半数抑制浓度(IC50)为0.96 μM。另一方面，化合物4 NPs在常氧条件下的IC50为2.15 μM，在缺氧条件下的IC50为2.52 μM。结果表明，化合物3 NPs比化合物4 NPs表现出更好的光毒性。我们假设3nps的这种增强的光毒性可能归因于其更高的BH4氧化和ROS生成能力，以及内质网内的积累。我们还评估了化合物3 NPs在BH4过表达细胞(如HT-29和AZ521细胞)中的细胞毒性。结果表明化合物3 NPs在这些细胞中有效发挥光动力治疗作用，HT-29细胞和AZ521细胞的IC50值分别为0.59 μM和0.73 μM。
为了进一步观察光照射下化合物3 NPs对HeLa细胞的抑制作用，我们采用钙黄蛋白AM/PI法。活细胞用钙素AM染色，绿色通道荧光;凋亡细胞用PI染色，红色通道荧光。在660 nm、40 mW/ cm2光照射10分钟后化合物3 NPs处理的细胞红色通道可见清晰的荧光信号，且红色荧光信号随浓度的增加而增强。相比之下，当化合物3 nps处理的HeLa细胞不受光照时，它们只发出绿色荧光，表明细胞没有死亡。为了探索细胞死亡的相关途径，我们利用不同的抑制剂靶向不同的细胞死亡途来调节细胞活力。凋亡抑制剂Z-VAD-FMK显著提高细胞活力，说明凋亡在化合物3 NPs诱导的细胞死亡中起着重要作用。此外，我们采用Annexin-V FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞术进一步研究了化合物3 NPs诱导的细胞凋亡。可以明显看出，在没有化合物3 NPs的情况下，大多数HeLa细胞在光照射处理下仍然存活。然而，随着化合物3 NPs浓度的增加，早期和晚期凋亡的HeLa细胞比例明显升高。上述结果表明，化合物3 NPs诱导细胞凋亡，杀伤肿瘤细胞。
体内PDT
我们利用BALB/c小鼠HeLa皮下肿瘤模型对免疫缺陷小鼠模型中的化合物3 NPs进行了PDT研究。首先，我们通过体内荧光成像实验确定了化合物3 NPs在肿瘤区域的富集时间，结果显示，静脉注射后3小时，化合物3 NPs在肿瘤区域积累。小鼠尾静脉注射化合物3 NPs (500 μg/mL, 50 μL) ;然后在注射后9小时对肿瘤部位进行25分钟(660 nm, 120 mW/cm2)的光照处理。在治疗后的21天内，小鼠的体重仅略有增加，与对照组相比，化合物3和光照射组的肿瘤生长明显受到抑制。第21天处死小鼠，切除所有肿瘤组织并称重。与未治疗组相比，治疗组的肿瘤大小和重量明显更小。对肿瘤组织进行体外caspase-3和TUNEL染色。结果显示治疗组的caspase-3表达明显高于对照组。此外，TUNEL染色结果显示，治疗组肿瘤中阳性细胞数量明显高于对照组，说明治疗组肿瘤细胞普遍凋亡。提示化合物3 NPs能有效诱导肿瘤细胞凋亡。
结论
本研究介绍了一种创新的光诱导歧化方法来设计一型光敏剂。我们提出了三个要求，包括合适的激发态能级和氧化还原电位，良好的分子间距离和聚集取向，以及有效的电荷分离，以设计这类一型PPs。为了验证这一概念，基于光诱导歧化机理制备了PSs。通过光诱导的同型染料分子间的电子转移，生成自由基离子对。阳离子自由基促进一种重要的辅酶——四氢生物terin (BH4)的氧化，而阴离子自由基将电子转移到分子氧中，导致O2－·的形成。通过额外的分子修饰，基于BODIPY 3在水中组装的光敏剂在内质网中表现出靶向定位，显示出有效的肿瘤细胞根除。值得注意的是，即使在低氧条件下(2% O2)，其对HeLa细胞也表现出明显的细胞毒性，半数最大抑制浓度(IC50)为0.96 μM。此外，对小鼠HeLa肿瘤模型有明显的抗肿瘤作用。尽管近年来出现了一些基于供体-受体结构的i型PSs，但其潜在的作用机制仍然是谜。i型PDT的设计策略缺乏明确性导致ROS生成的不可预测性，严重阻碍了i型PDT的发展。本研究i型PSs的合理设计提供了有价值的策略，并可能启发基于光诱导歧化机理制备i型PSs的探索。
参考文献
Photo-Induced Disproportionation-Mediated Photodynamic Therapy: Simultaneous Oxidation of Tetrahydrobiopterin and Generation of Superoxide Radicals, Kun-Xu Teng, Dongsheng Zhang, Bin-Kai Liu, Zheng-Fei Liu, Li-Ya Niu,* and Qing-Zheng Yang*,Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202318783，doi.org/10.1002/anie.202318783
