内容提要
本文开发了一种可行的“图像发射治疗”策略，将细菌感染的实时光学成像和同步光动力治疗(PDT)集成到持续发光(PL)纳米颗粒(NPs)中。以介孔二氧化硅NPs为衬底，原位沉积ZnGa2O4:Cr3+的PL纳米点，得到mPL NPs，然后与酞菁硅(Si-Pc)表面接枝，并静电组装花青素7 (Cy7)制备mPL@Pc-Cy NPs。光激活mPL@Pc-Cy NPs的PL发射在生理条件下通过荧光共振能量转移效应被Cy7组装猝灭，但在Cy7拆卸后响应细菌感染迅速恢复。NPs的自发光能力避免了外部光照射下的组织自身荧光，实现了细菌感染的实时比色成像。此外，mPL NPs的余辉可以持续激发Si-Pc光敏剂，促进PDT消除细菌的效果，加速伤口完全恢复正常的组织学特征。因此，本研究扩展了精确成像的治疗策略，同时对细菌感染进行非抗生素治疗，而不会对正常组织产生副作用。
实验结果与讨论
mPL NPs合成浴与表征
本研究以介孔二氧化硅NPs (MSNs)为衬底，原位沉积ZnGa2O4:Cr3+ (ZGC)的PL纳米点(NDs)，得到mPL NPs，然后用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)进行表面改性，得到氨化的mPL (mPL- NH2) NPs。以聚乙二醇(PEG)为连接剂，将Si-Pc偶联在NP表面制备mPL@Pc NP。将丁二酸酐偶联在NPs上制备mPL@Pc/COOH，再静电吸附Cy7得到mPL@Pc-Cy NPs。表面氨基和羧基的比例赋予NPs ph响应电荷反转。静电组装的Cy7通过荧光共振能量转移(FRET)效应猝灭mPL发射，在生理条件下(pH 7.4)不产生PDT效应。为了应对细菌感染的酸性环境(pH 5.5)， NP表面被逆转为带正电，Cy7的拆卸暂停了FRET效应。mPL NPs的发光特性可以实时监测伤口状况，同时激发Si-Pc产生ROS来杀死细菌。
由于MSNs具有生物相容性、介孔结构和高表面积，有利于吸附前驱体离子(Zn2+、Ga3+和Cr3+)，因此采用MSNs作为底物。ZGC前驱体在pH 7.5下成型，然后在120℃下进行水热处理，在MSN表面获得PL NDs。MSNs呈球形，平均尺寸为80 nm，在MSNs上沉积了大量平均尺寸为10 nm的PL nd。透射电镜(TEM)观察显示，MSNs表面有明显的PL ND层，厚度约为15 nm。元素映射分析表明，锌元素主要分布在硅芯周围。plnds在MSNs上的沉积使水动力直径从92 nm增加到117 nm，并使zeta电位从−24.31 mV降低到−15.22 mV。N2吸附-解吸测试显示，MSNs和mPL NPs均呈典型的Ⅳ型形状，验证了核心中孔结构的存在，并且在沉积PL NDs后，MSNs的BET表面积从660.3显著降低到273.2 m2 g−1。msn的平均孔径约为2.9 nm, mPL NPs的新平均BJH孔径为5.1和7.9 nm，表明壳中引入了更大的孔。MSNs的x射线衍射(XRD)图在21.8°左右表现出典型的宽峰，mPL NPs的x射线衍射(XRD)图显示出ZnGa2O4 (JCPDS No. 86-0415)的纯尖晶石相结构和MSNs的无定形二氧化硅相。msn的低角XRD在2.7°左右表现出强烈的信号，PL NDs的沉积降低了强度，表明mPL NPs的介孔不那么有序。以上结果表明在msn上成功沉积了PL NDs。
mPL@Pc-Cy NPs的表征
用氨基和羧基修饰mPL NPs，然后用Si-Pc和Cy7接枝，获得PL治疗平台。NaOH处理后，在mPL NPs表面引入羟基，随后与APTES反应得到mPL- NH2 NPs。在mPL NPs上引入氨基导致mPL- NH2 NPs的表面电位从- 15.22 mV恢复到14.03 mV。通过酰胺化反应将HOOC-PEG-Pc偶联在mPL NPs上，使其表面电位mPL@Pc (11.83 mV)略有降低，有利于通过静电相互作用吸附Cy7得到mPL@ Pc-Cy NPs。总结了改性mPL NPs的傅里叶红外(FTIR)光谱。在1133 cm−1处的吸收峰表明mPL NPs上成功引入了氨基，而HOOC-PEGPc的共轭显示mPL@Pc NPs的特征峰在1475 cm−1 (-C= Si-Pc的C-)， 1530 cm−1(酰胺II波段)，1633 cm−1 (C=O的拉伸振动)，1332和1065 cm−1 (Si-O-C)。此外，为了调节mPL@Pc NPs中Cy7的组装和拆卸，通过氨基与丁二酸酐反应引入羧基，得到mPL@Pc/COOH NPs。在1086 (C-O拉伸振动)和1598 cm−1(羧酸不对称拉伸振动)处的强吸收带表明羧基表面改性成功。需要注意的是，mPL的表面修饰对mPL@Pc-Cy NPs的形貌和晶型没有明显的影响。mPL@Pc-Cy NPs的水动力尺寸增加到158 nm。mPL@Pc NPs上的氨基密度为1.06µmol mg−1,mPL@Pc-Cy NPs的Si-Pc接枝量为72µg mg−1,Cy7负载量为1.8µg mg−1。
mPL NPs的激发和发射光谱，显示了以273、413和556 nm为中心的三个激发带。可见区(413和556 nm)的激发带归因于Cr3+的自旋允许跃迁，而273 nm的激发带归因于宿主吸收，表明能量从宿主转移到Cr3+。在254 nm的紫外光激发下，由于Cr3+的自旋禁止跃迁，在696 nm处检测到600 ~ 800 nm的红光至近红外辐射，峰值为696 nm。显示了发光二极管(LED)循环激活5min后，mPL NPs在696 nm处的余辉衰减情况。mPL NPs的余辉强度在最初几分钟内迅速下降，随后在4小时内逐渐下降。这种现象可以解释为mPL NPs的浅层和深层阱中储存的激发能释放迅速，跃迁缓慢。此外，LED照射后的荧光强度恢复，荧光强度循环衰减和再充电，没有明显衰减。mPL的发射光谱与Cy7的吸收光谱重叠，导致mPL供体与Cy7受体之间产生FRET效应。Cy7在779 nm处的发射是肉眼不可见的，这表明在mPL@Pc上组装Cy7可以淬灭mPL的发射，从而产生一个视觉传感平台。
pH依赖性荧光发射和1O2生成
为了实现表面电位的ph敏感调制，mPL@Pc NPs上的氨基与琥珀酸酐连接以引入羧基。总结了mPL@Pc NPs与琥珀酸酐在不同氨基与羧基摩尔比(NH2/COOH)下从1到200反应后mPL@Pc/COOH NPs的zeta电位变化。当NH2/COOH为1/1时，mPL@Pc/COOH NPs在pH 7.4 (- 37.51 mV)和pH 5.5 (- 6.59 mV)下的zeta电位均为负。当NH2/ COOH比增加到20/1时，zeta电位在pH 7.4和pH 5.5时分别增加到−13.14 mV和+16.56 mV。在不同的pH条件下，NPs上的氨基和羧基会以pH依赖的方式质子化和去质子化。与NH2/COOH比为10/1时的- 24.38/6.28 mV相比，pH 7.4和pH 5.5时的zeta电位更为对称，并用于后续的研究。此外，在细胞培养基中孵育24 h后，水动力尺寸和zeta电位没有明显变化，说明胶体和化学接枝的稳定性足够。
FRET效应来源于当受体和供体距离较近时，物理能量转移导致荧光猝灭，在一定的刺激下，它们之间的相互作用中断后，荧光信号可以恢复。具体而言，在生理条件下(pH 7.4)， mPL@Pc/COOH NPs带负电荷，可以静电组装Cy7，由此产生的mPL与Cy7之间的FRET效应可以抑制mPL的发射。在细菌感染的微酸性环境(pH 5.5)中，mPL@Pc/COOH发生表面电荷反转，带正电。此时，Cy7可以被静电排斥以暂停FRET效应，mPL NPs可以作为内部光源同时成像和PDT治疗。为了证实能量传递效应，我们对mPL发射强度进行了分析，发现静电吸附Cy7后mPL发射强度明显降低。通过改造前后排放强度的变化来确定能量传递效率E。mPL与Cy7之间的E值约为89.6%，表明两者之间存在较强的FRET效应。mPL和Si-Pc之间没有明显的非辐射能量传递(E = 11.9%)，说明水合PEG间隔剂扩大了两者之间的距离，导致两者之间没有明显的非辐射能量传递。图为mPL@Pc-Cy NP悬液在不同pH值缓冲液中的荧光光谱。在pH为7.4的条件下，将Cy7静电组装在mPL@Pc/COOH NPs上，mPL与Cy7之间的FRET效应导致Cy7在779 nm处发射。当pH值从7.4降低到5.5时，由于mPL@Pc/COOH NPs中Cy7的电荷依赖性分解，mPL NPs的荧光强度增加。直观地显示了pH值从7.4到5.5时颜色变为红色的变化。应该指出的是，mPL@Pc-Cy NPs的组装和拆卸过程是完全可逆的。随着pH从5.5增加到7.4，随着Cy7与mPL@Pc/ COOH NPs的重新组装，mPL NPs的荧光强度下降，红色逐渐变暗，恢复了FRET猝灭作用。此外，Si-Pc的吸收带在600 ~ 700 nm之间，与mPL NPs的发射带重叠，表明Si-Pc对PDT有潜在的激发作用。
生成的1O2可以与1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)反应，通常将DPBF在410 nm处的吸光度降低作为1O2产率的指标。mPL@Pc-Cy NPs被LED照明激活5分钟，总结了不同pH值下mPL@Pc-Cy NPs孵育后DPBF的吸收光谱。DPBF的吸收值仅在pH为7.4时略有下降，但当体系pH调整到5.5时，DPBF的吸收强度明显下降。当pH值在5.5和7.4之间循环切换时，mPL@Pc-Cy NPs可以响应pH值的变化，并表现出1O2的开关生成。总结了活化的mPL@ Pc-Cy NPs在pH 5.5缓冲液中孵育后DPBF的吸收光谱。DPBF的吸收值随时间逐渐降低，表明mPL NPs可以连续激发Si-Pc生成1O2。mPL的发射在pH为7.4时被淬灭，吸收强度随时间没有显著变化。结果表明，只有在酸性微环境下对Cy7进行静电排斥以暂停FRET效应，mPL NPs才能作为PDT处理的内部光源。此外，在pH为5.5的缓冲液中，经mPL@Pc-Cy NPs反复激活后，DPBF的吸光度强度下降更为明显。因此，研究结果表明mPL@Pc-Cy NPs可以在酸性环境下循环激活以引发PDT，并且余辉发射可以使1O2持续生成。
pH依赖性抗菌活性mPL@Pc-Cy/Light
金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌是急性和慢性伤口中最常见的细菌，分别作为革兰氏阳性和革兰氏阴性模型。作为一种强ROS, 1O2可以与病原体必需的大分子(如DNA、RNA和致病蛋白)发生反应，破坏细菌壁和细胞膜，诱导病原体死亡而不产生任何耐药性。用mPL@Pc-Cy/light、mPL@Pc/ light、mPL- cy /light、mPL/light、Pc/light和mPL@Pc-Cy处理后金黄色葡萄球菌计数的琼脂板，等效mPL剂量为200µg mL−1。当金黄色葡萄球菌在pH 5.5缓冲液中培养时，只有mPL@Pc-Cy/light和mPL@Pc /light处理表现出杀菌能力。总结了mPL@Pc-Cy/light(99.6%)和mPL@Pc/light(99.8%)的抗菌率，远高于其他处理(p < 0.05)。结果表明，LED激发后mPL NPs的余辉能够持续刺激Si-Pc生成1O2。mPL/light和mPL- cy /light体系中没有有效的光敏剂，Pc/light缺乏相应的激活源，对细菌生长无明显影响(p > 0.05)。此外，P. aeruginosa孵育后也观察到类似的结果，只有mPL@Pc-Cy/light和mPL@Pc/light处理的杀菌效果超过99.5%。此外，mPL@Pc-Cy/光处理在pH为7.4的缓冲液中没有杀菌效果， 因为mPL排放被组装的Cy7淬灭。
mPL、Si-Pc和Cy7已广泛应用于生物领域，毒性很小，mPL@Pc-Cy NPs对NIH-3T3细胞的细胞毒性分别在黑暗和光照后进行了评估。正如预期的那样，在黑暗中mPL@Pc-Cy孵育24小时后，即使在320µg mL−1的高剂量mPL下，细胞存活率仍然超过85%。mPL@Pc-Cy/光处理由于mPL发射猝灭和不产生1O2，表现出相似的细胞相容性。然而，mPL@Pc/光处理显示出剂量依赖性的细胞毒性，在320µg mL−1的等效剂量下，细胞存活率急剧下降至约28%。因此，Cy7的组装猝灭了光活化mPL的余辉发射，并且mPL@Pc-Cy/光处理在中性微环境中没有引起明显的细胞毒性。
mPL@Pc-Cy/光的体外细菌感知与破坏
在细菌培养系统中考察了mPL@Pc-Cy/light的体外杀菌效果。与pH 5.5缓冲液中的抑菌率相似，只有mPL@Pc-Cy/light和mPL@Pc/ light破坏了金黄色葡萄球菌，琼脂皿中没有活菌。总结了不同处理后的抗菌率。mPL@Pc-Cy/light与mPL@Pc /light的抑菌效果差异无统计学意义(p > 0.05)，抑菌率(> 99.5%)明显高于其他处理(p < 0.05)。此外，mPL@Pc-Cy/光处理对P. aeruginosa也有类似的效果。mPL@Pc-Cy/光处理后金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的扫描电镜(SEM)形态。未经处理的金黄色葡萄球菌呈表面光滑的球形结构，铜绿假单胞菌呈光滑的棒状形态。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌经mPL@Pc-Cy处理后，表面出现明显的皱纹和损伤，这是由于产生的1O2破坏细胞膜和菌壁所致。总之，mPL@Pc-Cy/光对细菌感染具有较高的敏感性和较强的杀菌效果。
在培养基中培养细菌后，检测mPL@Pc-Cy/light的细菌成像能力。细菌数量的增长会导致培养基中pH值的动态变化。总结了pH值和细菌数量随孵育时间的变化。随着培养时间的延长，细菌数量的增加，pH值逐渐下降，与金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌孵育24 h后pH值达到4.4左右。同时，活化mPL@Pc-Cy NPs的荧光强度随着细菌数量的增加而增加。显示了加入光活化mPL@Pc-Cy NPs后培养板内细菌悬浮液的颜色变化，对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的反应相似。在培养基中加入光活化的mPL@Pc-Cy NPs后，由于活化的mPL NPs与Cy7之间的FRET效应，没有颜色变化。细菌在培养基中生长产生酸性产物，金黄色葡萄球菌培养9.5 h，铜绿假单胞菌培养12.5 h, pH降至5.5。由于Cy7的分解，激活的mPL@Pc-Cy发出红色荧光，这与激活的mPL@Pc NPs相似。我们认为mPL@Pc-Cy/light NPs可以对细菌感染做出反应，在细菌生长后的酸性微环境下产生红色荧光。
mPL@Pc-Cy/Light的体内成像和抗菌能力
总结了不同处理后有无细菌感染的伤口部位图像。与mPL@Pc/light和mPL@Pc-Cy相比，只在感染创面添加mPL@Pc-Cy并光照后才观察到颜色变化，提示细菌感染微环境的特异性成像。体内余辉成像可以避免自身荧光背景，不需要外部连续激发。未活化的mPL NPs不产生余辉，PBS/光缺乏荧光受体;因此，两者都没有特异的荧光发射。伤口中的炎症细胞负责吞噬感染部位的细菌，由此产生的蛋白酶和自由基的释放会损伤组织，溶解胶原蛋白，明显延缓伤口愈合过程。为探讨抗菌效果，采用mPL@Pc-Cy/light、mPL@Pc/light、mPL@Pc-Cy、PBS/light治疗金黄色葡萄球菌感染创面后观察创面愈合情况，并与临床使用的万古霉素(VAN)作为阳性对照进行比较。VAN是临床上常用的抗生素，具有较强的杀伤金黄色葡萄球菌活性，但通常存在剂量依赖性肾毒性，这限制了其应用和治疗效果。图7b记录了感染创面的愈合过程，表明mPL@Pc /light、mPL@Pc-Cy/light和VAN处理后创面快速闭合。在前4天，所有伤口感染细菌的小鼠都出现了明显的伤口溃疡，表明细菌已经造成了严重的感染。mPL@Pc-Cy和PBS/光处理12天后，感染仍然显著，说明单纯依靠自身免疫系统，细菌很难被消灭。总结了不同处理后12天的伤口愈合率。mPL@Pc-Cy无光照处理伤口恢复率为61.3%，与PBS/光照处理(58.2%)比较差异无统计学意义(p > 0.05)。mPL@Pc/ light、mPL@Pc-Cy/light、VAN均可促进创面愈合，12天后创面基本完全愈合。治疗4天后检查感染伤口的细菌水平。显示了活菌在琼脂板上的菌落形成情况，mPL@Pc/light、mPL@Pc-Cy/light和VAN处理后细菌很少。如图7e所示，其抑菌率均在99.5%以上，显著高于PBS/light和mPL@ Pc-Cy处理组(p < 0.05)。这些结果与伤口恢复和体外抗菌测试一致。此外，在给药12天后，使用苏木精和伊红(H&E)染色对感染伤口进行组织学检查。PBS/ light和mPL@Pc-Cy治疗后，感染部位可见大量炎性细胞。mPL@Pc/light、mPL@Pc-Cy/light和VAN处理后伤口被完整皮肤覆盖，有大量成纤维细胞和毛囊绒毛，与正常皮肤相似。
结论
通过原位沉积PL NDs、Si-Pc光敏剂表面偶联以及Cy7作为FRET受体的静电组装制备了mPL@Pc-Cy NPs。Cy7在生理条件下淬灭mPL排放，不产生PDT效应，避免了光激活mPL@Pc-Cy NPs的细胞毒性和组织损伤。mPL NPs可以作为内部光源，在细菌感染的酸性环境下持续激发光敏剂产生ROS，克服传统PDT耐久性短的缺点。此外，mPL@Pc-Cy NPs可以响应细菌生长并产生红色荧光，用于细菌感染的视觉监测。在mPL@Pc-Cy/light治疗后，仅在感染伤口观察到颜色变化。创面基本愈合，组织学特征正常，创面正常组织未见明显病理异常。
参考文献
Persistent Luminescence-Based Theranostics for Real-Time Monitoring and Simultaneously Launching Photodynamic Therapy of Bacterial Infections. Zhanlin Zhang, Hui Yan, Bo Qiu, Pan Ran, Wenxiong Cao, Xinwei Jia, Kun Huang, and Xiaohong Li*，Small 2022, 18, 2200813，https://doi.org/10.1002/smll.202200813.
