内容提要
目前报道的光敏剂在缺氧条件下通常表现出活性氧（ROS）产生减少的特性，这是光动力学疗法（PDT）治疗实体肿瘤临床失败的主要原因。在此，首次报道了曙红Y（Eos）的低氧诱导的发光自由基用于低氧肿瘤的有效光疗。更重要的是，Eos在低氧条件下比在常氧条件下显示出更高的ROS和自由基产生效率。电子顺磁共振捕获的光生自由基，并进一步验证了活性氧和自由基探针。引入CoCl2作为缺氧诱导剂，缺氧癌细胞模型和荷瘤小鼠的光诱导治疗表明，缺氧肿瘤部位的牛血清白蛋白-Eos可以产生更高的肿瘤毒性，从而跨越缺氧肿瘤治疗的临床障碍。这种非氧依赖性PDT可能开辟了一条与缺氧作斗争的途径。
结果与讨论
牛血清白蛋白具有良好的生物相容性，已被广泛用作药物载体。在水溶液（pH = 5.5）中，以EDC·HCl和NHS为偶联剂，通过Eos的羧基与BSA的氨基形成酰胺键，得到BSA-Eos。通过紫外-可见（UV-vis）光谱计算，约六个EOS分子与一个BSA偶联。通过动态光散射（DLS）测定，得到的BSA−Eos的尺寸为14.5 ± 2.2 nm，大于游离BSA的尺寸（8.5 ± 1.5 nm），BSA−Eos的表面电位为-10 mV，比游离BSA的-6 mV更负，表明Eos成功地与BSA偶联。在Tris·HCl缓冲液（pH 7.4）中测定BSA−Eos的物理化学性质。Eos在440 - 550 nm范围内具有强烈的吸收，最大吸收在517 nm处。记录了不同pH值（5.5、6.5和7.4）下的紫外维斯光谱和荧光光谱。pH值对紫外维斯光谱和荧光光谱都没有影响。还记录了BSA-Eos在常氧（用20%气体VO 2/VN 2鼓泡30 min）和缺氧（用5%气体VO 2/VN 2鼓泡30 min）中的UV-维斯光谱以进行比较。没有发现Eos的吸收变化，表明BSA−Eos的结构在常氧和缺氧条件下都得到了很好的保留。
利用电子顺磁共振（EPR）技术，以TEMPO为自旋捕获剂，对辐照过程中的·Eos自由基和1O2进行了捕获。在甲醇中缺氧或常氧条件下照射（5 min，293 K）后，分别检测到单线态氧和·Eos自由基TEMPO-1O2和TEMPO-·Eos。TEMPO-·Eos（用蓝色星号标记）仅在缺氧条件下检测到，而TEMPO-1O2（用红色星号标记）在缺氧和常氧条件下均能发现，表明缺氧条件下Eos诱导了发光自由基过程。提出了Eos的非氧依赖性光动力效应的可能机制。在常氧条件下，激发态的Eos（*Eos）被周围的氧猝灭，产生532 nm照射的单线态氧。同时，在缺氧条件下，激发态 *Eos可以被周围的分子还原，形成自由基·Eos。单线态氧和高活性的·Eos都能产生细胞毒性，实现非氧依赖性PDT。缺氧条件下的发光自由基过程类似于先前报道的碱性条件下Eos（Eos-Br）的脱溴作用。显示了532 nm激光照射前后Eos的不同紫外-维斯光谱（20 mW/cm2），这可以进一步证实Eos-Br是通过发光自由基过程产生的。发现在常氧下Eos的吸光度降低，这可能归因于ROS对Eos的光降解。然而，发现缺氧中Eos的吸收峰从517 nm蓝移到500 nm，与以前的报告类似，这可以归因于通过发光自由基机制形成Eos-Br。
用探针2，7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFHDA）进一步证实了ROS和·Eos自由基的产生。DCFH-DA在NaOH溶液中分解后，与活性氧（ROS）和·Eos自由基反应，生成2，7-二氯荧光素（DCFH）。研究了BSA−Eos在常氧和缺氧条件下产生的ROS和自由基，使用亚甲蓝（MB）进行比较。在Eos或MB存在下，在5%或20%氧气下，分别通过532或660 nm激光照射，在524 nm处的DCF荧光强度的曲线。在缺氧和常氧条件下，在524 nm处清楚地观察到逐渐增加的荧光峰。此外，ROS和·Eos自由基在缺氧条件下产生的BSA− Eos比常氧条件下高约两倍。相比之下，发现参比MB在缺氧条件下产生的ROS仅为常氧条件下产生的ROS的三分之一，证实BSA-Eos可能是缺氧的优秀光敏剂，增强PDT。
受缺氧条件下光动力转换效率显著增强的鼓舞，我们随后通过缺氧模型探索了Eos对HeLa细胞的抗癌作用，以进一步证明BSA−Eos可以作为缺氧增强光疗的潜在光敏剂。首先通过典型的比色细胞活力CCK-8测定法研究了BSA-Eos在黑暗中对HeLa细胞的毒性。在黑暗条件下，将不同浓度（0、10、12.5、25、50、100、120、250和500 ppm）的BSA-Eos与HeLa细胞孵育12和24 h，未发现明显的毒性。然后，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行BSA-Eos对HeLa细胞的内吞。当与HeLa细胞在37 °C下孵育0、1、2和4 h时，细胞中BSA−Eos的荧光逐渐增加。此外，很明显，BSA-Eos主要分布在HeLa细胞的血浆中。随后，引入CoCl2，缺氧诱导剂，以构建细胞的缺氧模型。氯化钴诱导细胞缺氧主要有两种方式。一方面，钴可以直接取代血红素样物质中的Fe2+，破坏与氧的结合性，保持脱氧作用，以模拟细胞缺氧。另一方面，以氯化钴为血红素酶底物合成的血红素样蛋白会失去携氧活性。由于细胞在缺氧状态下一般会导致硝基还原酶（NTR）的增加，因此检测NTR的表达可以间接衡量细胞缺氧的程度。为了验证氯化钴诱导的细胞缺氧模型的成功构建，使用商业NTR探针检测细胞缺氧水平。将CoCl2（0、50、100和200 ppm）与HeLa细胞孵育4小时。如图3d所示，随着氯化钴浓度的增加，检测到NTR探针在600 - 650 nm处的荧光明显增加，证实了细胞在与氯化钴孵育时处于缺氧状态。
然后在低氧和常氧条件下在HeLa细胞中进行光疗实验，以研究BSA−Eos的低氧辅助增强光疗。将细胞与CoCl2（100 ppm）孵育4小时，然后加入BSA−Eos（100 ppm）再孵育4小时。用培养基洗涤后，用532 nm激光（20 mW/cm2）照射BSA-Eos负载的HeLa细胞，并再孵育24小时。激光组和材料（BSA-Eos）在缺氧（含CoCl2）和常氧（不含CoCl2）下均未表现出明显的细胞毒性，表明HeLa细胞可在缺氧条件下保持存活。在常氧条件下，当用532 nm激光（20 mW/cm2）照射1、3和5 min时，BSA-Eos与HeLa细胞共培养物中的细胞活力分别为83.0、65.2和50.5%。相反，在CoCl2存在下，与BSA−Eos共培养的HeLa细胞的细胞活力分别下降至74.2%、47.8%和20.3%，证实了在CoCl2构建的缺氧环境中细胞毒性明显增强。为了进一步证实BSA-Eos在HeLa细胞中的光疗效率，通过CLSM进行活细胞（AM）和死亡细胞（PI）的共染色。与对照组（C，与细胞培养基一起孵育）相比，在黑暗中与BSA−Eos（B）、CoCl2（Co）以及BSA−Eos和CoCl2（B + Co）共培养的HeLa细胞均保持存活。单纯激光照射组（C + L）和激光照射CoCl2组（Co + L）未见明显毒性反应。有趣的是，激光组（B + L）和激光+CoCl2组（B + Co + L）的BSA-Eos中发生了明显的细胞死亡。更重要的是，发现在缺氧条件下（B + Co + L）比在常氧条件下（B + L）更增强的细胞毒性。此外，通过DCHF-DA染色测定来测量活细胞中ROS的产生。对照组没有显示出绿色发射，而B + Co + L组和B + L组被染成绿色，视觉上证实了ROS的产生。缺氧模型组B + Co + L的荧光强度也高于常氧组（B + L）。上述结果表明，在癌细胞缺氧时，BSA−Eos的光疗特异性增强，在进一步的缺氧辅助增强PDT中显示出很大的潜力。
上述体外结果清楚地表明，BSA-Eos在缺氧条件下具有优异的治疗效果，这鼓励我们将其应用于体内应用。首先，研究了BSA−Eos在主要器官（包括肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）中的体内分布。BSA-Eos在静脉内注射BSA−Eos 2 h。此外，在体内进行了详细的生物安全性评价，包括血液生化、全血检查以及基于小鼠体重（5、10和15 mg kg−1）连续30天静脉注射BSA−Eos的组织学和重量分析。用BSA−Eos处理的小鼠的血液参数与对照组（即用PBS处理的健康小鼠）的血液参数相当，无统计学显著差异。此外，与对照组相比，用BSA−Eos处理的小鼠主要器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的苏木精和伊红（H&E）染色切片也显示无组织学病变。此外，不同剂量的BSA-Eos对小鼠的体重无明显影响，小鼠健康，体重随时间增加，表明BSA-Eos作为理想的光疗剂具有较高的生物安全性。随后，通过HbO2/Hb模型的光声成像证实通过瘤内注射CoCl2进行的缺氧模型。肿瘤内注射CoCl2 2h后，实体瘤中的氧水平明显降低，表明CoCl2即使在缺氧条件下也能赋予肿瘤。
最后，通过静脉注射进一步系统地进行了BSA-Eos辅助的HeLa荷瘤裸鼠体内光疗。首先，将40只小鼠随机分为8组（n = 5），分别为对照组（C）、BSA-Eos组（B）、CoCl2组（Co）、BSA-Eos + CoCl2组（B + Co）、激光组（C + L）、CoCl2+激光组（Co + L）、BSA-Eos+激光组（B + L）、BSA− Eos激光组和CoCl2组（B + Co + L）。更重要的是，CoCl2瘤内注射建立肿瘤缺氧模型。PDT治疗后，每2天测量裸鼠体重和肿瘤体积。如图4 b所示，所有组中小鼠的体重随时间略微增加。值得注意的是，对照组、BSA−Eos、CoCl2、BSA−Eos和CoCl2、激光组以及CoCl2+激光组小鼠的肿瘤体积持续增加。相反，小鼠的肿瘤体积在B + L组中显示轻微增加，表明肿瘤生长受到抑制。更有趣的是，在低氧光疗模型中，发现治疗组（B + Co + L）中的肿瘤被完全抑制，且无复发。各组光疗照片见图，认为如此高的抑瘤效率主要归因于缺氧辅助增强BSA−Eos的PDT。为了进一步评价BSA-Eos对肿瘤的作用，使用TUNEL、H&E染色和Ki-67来评价532 nm激光照射10 min后BSA-Eos的光疗疗效。与其他组相比，B + Co + L组中肿瘤组织中的肿瘤细胞坏死率最高，证实了高抗肿瘤疗效。进行Ki-67抗体染色以显示癌细胞的增殖活性。对照组、BSA-Eos、CoCl2、BSA-Eos和CoCl2、激光组和CoCl2+激光组的肿瘤区域显示出显著的核多态性和细胞增生。值得注意的是，与B + L组相比，治疗组B + Co + L显示出更高水平的细胞坏死和受抑制的增殖活性，证实了低氧光疗模型的增强的抗肿瘤功效。
结论
本研究首次构建了一种新型的BSA-Eos偶联物，并证明了其在缺氧条件下能光生自由基，对抗肿瘤缺氧。所获得的BSA-Eos在缺氧（5%O2）条件下表现出增加的ROS和自由基产生效率，主要是因为光生自由基机制。通过引入CoCl2作为缺氧诱导剂，体内研究证实，缺氧肿瘤部位的BSA−Eos可以产生更高的ROS来损伤癌细胞，这可能克服缺氧肿瘤治疗的临床障碍。这种有趣的非氧依赖性PDT有望为PDT治疗缺氧肿瘤开辟一条新的途径。
参考文献
Hypoxia-Induced Photogenic Radicals by Eosin Y for Efficient Phootherapy of Hypoxic Tumors，Fengfeng Xue, Wenxian Du, Shixiong Chen, Ming Ma, Yichen Kuang, Jufeng Chen, Tao Yi,* and Hangrong Chen*，ACS Appl. Bio Mater. 2020, 3, 8962−8969，https://dx.doi.org/10.1021/acsabm.0c01223
