内容提要
本文报道了一种含有萘醌轴向配体作为低氧响应性a前药样部分（Prodrug-SiPc）的载硅酞菁（SiPc）脂质体。借助计算方法，本研究评估了Prodrug-SiPc的物理、光化学和电化学氧化还原性质，以阐明材料结构与性质之间的关系。轴向醌部分的连接赋予Prodrug-SiPc I/II型光化学和前药样性质。在脂质体包封后，针对作为体外癌症模型的Michigan Cancer Foundation-7（MCF-7）和亨里埃塔Lacks（Hela）癌细胞研究Prodrug-SiPc-脂质体的治疗功效，并揭示合成的Prodrug-SiPc-脂质体是潜在的光动力疗法（PDT）药物候选物。Prodrug-SiPc-脂质体充分利用肿瘤的缺氧微环境-PDT的副作用-来触发治疗，与典型的PDT相比，导致显著增强的功效。这项工作突出了多重特性在设计新的有效光敏剂候选物中的重要性。
实验结果与讨论
Prodrug-SiPc的合成与表征
在氩气下，将硅酞菁氯醌、SiPcCl2（100 mg，0.16 mmol）和指甲花醌（2-羟基-1，4-萘醌，142 mg，0.81 mmol）的混合物在二甲基甲酰胺（DMF，20 mL）中搅拌20 min。将所得溶液在真空下干燥。使用CHCl3：甲醇（99：1）通过柱色谱分离所需的Prodrug-SiPc）。在无水DMF中，在K2CO3存在下，SiPcCl2与2-羟基-1，4-萘醌（指甲花醌）发生碱催化的置换反应，合成了前药SiPc。在672 nm处，原样合成的Prodrug-SiPc的Q带位置与母体Cl 2SiPc的Q带位置无明显变化。与母体Cl2SiPc相比，Prodrug-SiPc复合物的未改变的Q带位置与DFT计算一致，其预测HOMO-LUMO间隙无显著变化。在Prodrug-SiPc复合物的光谱中的400-500 nm区域中观察到电荷转移带（CT），其在母体Cl2SiPc的光谱中不存在。预测该CT带是由引入轴向萘醌部分后的配体内（π-π*）和Pc至配体（π-π*）跃迁产生的。
引入了萘醌轴向配体，从而合成了前药SIPC，同时伴随着Prodrug-SiPc的紫外-可见光谱中B带吸收强度的增强(<；400 nm)，这归因于存在与萘环相关的电子跃迁。在一定的浓度范围内，使用Lambert-Beer定律验证了Prodrug-SiPc没有聚集。单体行为的浓度范围内的保留表明，附着的萘醌轴向配体通过防止溶液中大环之间的分子间π堆积作用有效地隔离了发色的sipc环，这可能被证明有利于ROS的生成。
Prodrug-SiPc复合物的归一化激发、吸收和发射光谱。激发光谱是发射光谱的镜像。吸收和激发最大值的接近表明吸收物种与发射物种相同，并且排除了溶液中的聚集。Prodrug-SiPc在682 nm处显示荧光发射，其与母体Cl 2SiPc的荧光发射相比略微红移。Prodrug-SiPc复合物表现出单指数光致发光衰减，光致发光寿命为4.58 ns，使用文献中报道的比较方法测定的荧光量子产率（ΦF = 0.37），以ZnPc作为标准品（ΦF = 0.20，在DMSO中）。前体药物-SiPc复合物的较低荧光量子产率和寿命值（与Cl 2SiPc相比）可归因于轴向萘醌部分的吸电子效应，其作用是使激发的单线态失活，同时鼓励系统间交叉至三线态。通过观察其吸收特性的变化来评价合成的Prodrug-SiPc复合体的光稳定性。光敏剂产生的ROS可能不可避免地导致光漂白，严重影响PDT的光敏化能力和效果。前药物-SIPC络合物的Q和B带光谱在近红外(NIR，680 nm)照射期间保持其原有的形状和强度，间隔2分钟。Prodrug-SiPc络合物的吸收特性在光照射后没有明显变化，这意味着它在研究范围内是稳定的。
激发态氧化还原性质和活性氧物质产生
采用电子自旋共振来深入了解合成的Prodrug-SiPc的光化学，以确定其ROS产生能力（102、·OH和02·-）。2，2，6，6-四甲基哌啶（TEMP）用于探测光产生1 O2。TEMP被单线态氧特异性氧化成顺磁性的2，2，6，6-四甲基哌啶基氧基（克里思），检测为三个等强度的超精细分裂信号。当合成的前药物-SIPC的溶液在TEMP存在下照射时，检测到三重TEMPO ESR信号。在没有辐射的情况下，无法检测到明显的信号。只有在照射后才能观察到节奏信号，这表明前药物-SIPC具有光诱导的单线态产氧能力。5，5-二甲基-1-吡咯啉N-氧化物(DMPO)用于检测前体药物SIPC产生·OH或O2·-的情况。ProPharmgSiPc和DMPO的ESR信号在没有光的情况下是静默的。然而，近红外辐射导致了具有DMPO-·OH加合物特征的4个强度为1：2：2：1的超精细分裂信号的ESR信号的出现，这表明DMPO-·OH加合物的光产生。已知羟基自由基的光化学生成是通过PS阴离子中间体进行的。为了便于比较，图中显示了由Cl2SiPc的光照射产生的TEMP和DMPO ESR信号。Cl2SiPc辐照后产生单线态氧和羟基自由基，尽管与前药物-SIPC络合物相比程度较小。根据文献中报道的方法，使用1，3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）作为单线态氧清除剂和ZnPc作为标准物，通过比较方法测定合成的脯氨酸药物-SiPc复合物的单线态氧量子产率（ΦΔ）（在DMSO中ΦΔ = 0.67）。DPBF很容易与单线态氧反应，形成不稳定的过氧化物，分解成（无色）1，2-二苯甲酰基苯并二苯，这一过程可以通过紫外-可见光谱进行监测。在用NIR光照射Prodrug-SiPc后，DPBF在417 nm处的吸收降低。Prodrug-SiPc的102量子产率（ΦΔ = 0.22）高于Cl 2SiPc的1O2量子产率（ΦΔ = 0.18）。前体药物-SiPc的单线态氧生成效率的提高可能归因于轴向萘醌基团的分子内电子转移效应。所合成的Prodrug-SiPc的双重单线态氧和羟基自由基产生能力可以证明有利于PDT应用。
细胞活性氧（ROS）的测定
在评价Prodrug-SiPc-脂质体的体外抗癌效果之前，先测定细胞内活性氧簇(ROS)，然后评估其光激活细胞内ROS生成的能力。我们以MCF-7细胞为模型，研究了前药-SiP脂质体是否能够在体外产生ROS。这是用2‘，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)实现的。支持信息中提供了详细信息。在细胞摄取后，脱乙酰化形式的DCFH-DA可以被ROS氧化成绿色荧光2‘，7’二氯荧光素(DCF)。用前药-SiP脂质体(300μg/m L)处理后，用DCFH-DA孵育细胞，然后用680 nm、0.28W/cm2的近红外激光照射。在Synergy 2多模式微型平板阅读器(BioTek®)上，在激发和发射波长分别为485和535 nm的多平板阅读器上测量DCF荧光。PBS单独培养的细胞(阴性对照)没有显示出任何明显的绿色荧光。另一方面，细胞暴露于H2O2(阳性对照)或前药物-SIPC-脂质体加光照射后，内化的前药物-SiPC-脂质体的DCF荧光、强光响应性ROS产生显著增加。然后在NIR照射后，通过典型的比色细胞活力WST测定法，在各种浓度下评估Prodrug-SiPc-脂质体诱导MCF-7细胞和HeLa细胞的细胞死亡的潜力。在没有激光照射的情况下测定暗细胞毒性。在相对常氧条件下评估细胞毒性特征，主要保持在37 ℃、5% CO2气氛中。Prodrug-SiPc-脂质体即使在使用的最大浓度（300 μg/mL）下也具有可忽略的暗毒性，表明其体外良好的细胞相容性。在NIR激光照射后，两种细胞类型的细胞活力均显著降低。对于前药-SiP脂质体观察到剂量依赖性光毒性和因此细胞活力的降低，导致约55%的MCF-7细胞死亡，而相同浓度在300 μg/mL下导致HeLa细胞中60%的细胞死亡。我们已经报道了使用常见的锌酞菁的类似%细胞死亡。对于两种细胞类型，在单独暴露于辐照的组中未观察到细胞活力的显著变化，表明单独的NIR辐照以及因此NIR辐照的加热效应对系统的细胞毒性效应没有贡献。
还通过WST细胞活力测定法在乳腺癌和宫颈癌（MCF-7和HeLa）细胞中在缺氧下评估所用Prodrug-SiPc-脂质体的细胞毒性。对于两种细胞类型，前药SiPc-脂质体在所研究的浓度范围内没有显示出任何固有的暗细胞毒性，表明其生物相容性。当用NIR光（680 nm）照射未处理的细胞（无药物）时，两种细胞系均未观察到细胞死亡。
对于MCF-7和HeLa细胞，在低氧和常氧下都观察到了类似的光毒性。在低氧和光照射条件下，前药物-SIPC-脂质体处理的细胞对两种细胞的存活率都下降到55%左右。低氧下的光毒作用可能归因于Pc和其组成的奎宁部分的协同治疗作用。
我们用HeLa细胞比较了合成的前药物-SIPC-脂质体和Cl2SiPc-脂质体的光动力学效应。没有表现出预期的光催化活性，因为它在水介质中不能产生与SIPC相同程度的ROS，单重态氧量子产率仅为0.010。经近红外线照射后，经Cl2SiPc脂质体处理的细胞组细胞存活率显著下降。然而，在所采用的低氧条件下，观察到Cl2SiPc的PDT效应减弱。对于Prodrug-SiPc-脂质体，当使用CoCl2诱导缺氧时，PDT活性有明显的改善。认为Prodrug-SiPc-脂质体的光动力学作用消耗了细胞内的氧来产生ROS。尽管PDT在低氧条件下的作用有限，但原药物SiPc的电位降低和激活可能在一定程度上补偿了低氧条件下PDT活性的减弱而产生化疗效应。上述结果证实了所用Prodrug-SiPc-脂质体的抗癌效果，以及在低氧条件下优先激活的纳豆醌部分的存在，可能导致了在常氧或低氧条件下的放大治疗作用。Prodrug-SiPc-脂质体的光毒性通过双色荧光细胞活力测定定性证明。将用Prodrug-SiPc-脂质体处理的96孔板中的HeLa细胞用ReadyProbes™细胞活力成像试剂盒，蓝色/绿色（Invitrogen）染色，并在使用NIR激光（280 mW.cm-2）照射后通过EVOS FL Auto 2荧光显微镜进行研究。活/死染色测定显示Prodrug-SiPc-脂质体在低氧孵育下相对于对照实现持续的PDT应答。在所采用的缺氧条件下，Prodrug-SiPc-脂质体导致大量的死细胞，这由绿色荧光显示。Prodrug-SiPc-脂质体即使在缺氧下的持续PDT活性可归因于连续醌部分的活性。Prodrug-SiPc-脂质体的有效细胞毒性证明了低氧响应性前药和PDT的协同效应。
我们还使用MCF-7细胞（作为实例）在常氧和缺氧下评估了所采用的Prodrug-SiPc-脂质体对细胞形态的影响。用Prodrug-SiPc-脂质体处理或仅照射的细胞呈现与对照细胞相似的形态（数据未显示）。然而，在用Prodrug-SiPc-脂质体处理的细胞照射后注意到显著的形态学变化。许多MCF-7细胞经历显著的细胞收缩和质膜起泡，典型的凋亡特征。这些结果与WST体外PDT测定结果良好一致，并证实了所用前药SiPc-脂质体的抗癌作用。
结论
本文报道了一种新型Prodrug-SiPc-脂质体的合成、表征及其体外光动力学治疗活性。这项工作表明，轴向的萘醌部分导致了Prodrug-SiPc的光物理性质的变化，从而改变了ROS的产生类型和数量。它还描绘了前体药物-SIPC用来增强·OH产生的各种途径。此外，利用PDT缺乏的内在和PDT加重的低氧，进行PDT和低氧激活的协同治疗，以提高治疗效果。本文报道的工作证实了这样的假设，即萘醌与酞菁核的配位赋予了与癌症治疗相关的氧化还原性质。这种近红外反应的PDT活性前药在缺氧和缺氧条件下都具有治疗癌症的巨大潜力。
参考文献
A hypoxia responsive silicon phthalocyanine containing naphthquinone axial ligands for photodynamic therapy activity ，Nnamdi Nwahara , Garth Abrahams , John Mack , Earl Prinsloo , Tebello Nyokong ,J. Inorg. Biochem. 239 (2023) 112078，https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2022.112078
