内容提要
本文开发了一种特定的纳米平台(ICG-PFH/MOF/DNA-Dox)，不仅可以用于靶向荧光成像引导光化学疗法，还可以用于调节缺氧肿瘤微环境以治疗癌症。该平台以金属有机骨架(MOF)为核心，以双链核酸(dsDNA)为壳层，同时编码ATP适体和AS1411适体，用于多柔比星(Dox)锚定，作为吲哚菁绿(ICG)和全氟己烷(PFH)的载体。因此，ICG-PFH/MOF/DNA-Dox通过识别肿瘤细胞膜上的核蛋白受体位点，在ATP触发dsDNA解离导致线粒体中的Dox受控释放以实现化疗(CT)后，显示出对肿瘤的活性靶向。在单次激光照射下，ICG既可以作为光热剂发射热量用于光热治疗(PTT)，也可以作为光敏剂产生活性氧用于肿瘤的光动力治疗(PDT)。负载的PFH作为缺氧PDT和CT的氧气自供剂。
实验结果与讨论
ICG-PFH/MOF/DNA-Dox的制备与表征
以UiO-66-N3的MOF作为纳米载体负载ICG和PFH，呈现典型的八面体构型，平均尺寸为95.5±8.8 nm。在2116 cm−1处的傅里叶红外变换(FT-IR)峰证实了N3基团的存在。通过N3-DBCO点击化学反应，用cDNA1、cDNA2和bDNA组成的dsDNA复合物密封后，将Dox插入dsDNA中，形成ICG-PFH/MOF/DNA-Dox。透射电子显微镜(TEM)图像显示，ICG-PFH/MOF/DNA-Dox的形貌没有明显变化，保持良好的分散性，平均尺寸为97.1±11.5 nm。
为了进一步提高治疗效率，将Dox加载到dsDNA中形成ICG-PFH/MOF/DNA-Dox，双链中的GC对为Dox提供了忠实的加载方式。细胞中的ATP可以解离dsDNA，从而释放Dox。PAGE结果证实了cDNA1、cDNA2和ATP适配体(lane 1-4)杂交形成的dsDNA。dsDNA特别设计了一个1-nt间隙，旨在加速atp触发的解离。缺口dsDNA暴露在较低浓度(1 mM)的ATP下可以被分解，释放出cDNA1等自由序列(lane 5)。相应地，ICG- PFH/MOF/DNA-Dox释放出39.2%的Dox，通过记录荧光光谱进行监测( I)。需要注意的是，激光照射下PTT引起的温度升高也会使部分dsDNA去杂交，释放出18.4%的Dox。ATP和激光照射的协同作用导致最高的释放效率为73.5%，表明这两种刺激可以协同促进dsDNA的解离，PAGE分析中明显的属于解离的cDNA1和cDNA2的条带证实了这一点,( lane 7)。在不同的刺激下，还监测了Dox的释放时间依赖性， Dox在1 h内快速释放。还研究了不同pH条件下，有或没有ATP +激光刺激的Dox和ICG释放。使用ATP +激光的Dox和ICG的释放率比不使用触发器的Dox和ICG的释放率高，这表明ATP和激光的结合可以有效、快速地释放Dox和ICG，而不受pH值的影响。此外，在没有ATP +激光刺激的情况下，Dox和ICG的释放水平降低，表明MOF结构相对稳定。还表明，在生理条件下，ICG-PFH/MOF/DNA-Dox可以保持相对稳定，在PBS溶液中72 h只观察到轻微的降解。
ICG-PFH/MOF/DNA-Dox的细胞靶向和摄取
靶向治疗可提高治疗效率，减少副作用。本文以HepG2和4T1肿瘤细胞、L-02和NIH 3T3正常细胞为模型，评价ICG-PFH/MOF/DNA-Dox的细胞靶向能力。与ICG-PFH/MOF/DNA-Dox共孵育4小时后，癌细胞的Dox荧光和ICG荧光均明显强于相应的正常细胞系。这主要是由于dsDNA中的AS1411适体可以靶向癌细胞膜上的核蛋白，增强探针在细胞内的摄取。癌细胞中的ATP与ATP适配体结合，使dsDNA去杂交，释放Dox，产生明显的绿色荧光。双相解离将解锁mof，进一步释放ICG，显示红色荧光。发现ICG主要位于细胞质中，而Dox则出现在细胞核中。因此，PTT, PDT和CT可以作用于细胞的不同部位，以提高治疗效率。我们记录了不同时间段HepG2细胞内ICG-PFH/ MOF/DNA-Dox的细胞内分布。随着培养时间的延长，ICG- pfh /MOF/DNA-Dox的细胞摄取表现出时间依赖性的内吞作用，ICG和Dox荧光逐渐增强。有趣的是，ICG和Dox在不同时间点的细胞内定位表现不同。在1 h的孵育时间内，由于细胞摄取有限，ICG和Dox的荧光较弱。在2 h时，记录到较强的ICG和Dox荧光，两者主要分布在细胞质中。随着时间的延长(4 h)， ICG仍主要出现在细胞质中，而Dox的位置逐渐与细胞核匹配，表明Dox进入细胞核。此外，在近红外照射下，细胞核中的Dox荧光增强，验证近红外照射下产生的热量确实有助于熔化dsDNA，加速Dox的释放和核摄取。单次激光照射后，ICG-PFH/ MOF/ DNA-Dox处理的HepG2细胞的3D放大Zoom CLSM图像进一步证明了这一结论，其中细胞核内表现出强Dox荧光。为了明确Dox释放的机制，我们用线粒体标记染料MitoTracker@Green对ICG-PFH/MOF/ dna -Dox处理的HepG2细胞进行共染色。观察到，绝大多数Dox荧光与MitoTracker@Green共定位良好，而与ICG-PFH/MOF/DNA-Dox共孵育2小时后，有一小部分进入细胞核，确保探针在线粒体中的优先积累和随后的ATP响应性Dox释放。
细胞水平下缺氧缓解
采用RDPP作为O2探针，其红色荧光可被O2猝灭。以DCFH-DA作为ROS指示剂，ROS可增强绿色荧光。在常氧条件下(21% O2)， ICG/ MOF/DNA处理的HepG2细胞的RDPP荧光被周围O2淬灭，与PBS组一样，而激光照射后DCFH-DA的绿色荧光由于ICG介导的ROS生成而明显增强。在ICG-PFH/MOF/DNA组中也观察到类似的现象。然而，在低氧环境(1% O2)下，即使激光照射，ICG/MOF/ DNA处理的HepG2细胞也只能监测到RDPP的红色荧光，这证实了ICG在低氧微环境下难以有效生成ROS。一旦PFH被加载到纳米药物递送系统中，在ICG-PFH/MOF/DNA + NIR处理的HepG2细胞中，RDPP的红色荧光被淬灭，因为ICG成功地吸附光产生热量，帮助PFH释放O2。生成的O2可以进一步提高ICG的ROS生成，大大增强DCFH-DA的荧光。流式细胞术结果进一步支持了这一结论，激光照射后，经ICG-PFH/MOF/DNA处理的缺氧细胞ROS荧光增加，O2荧光降低。因此，负载PFH可以将缺氧转移到富含O2的微环境中，从而提高治疗效率。在4 T1癌细胞中也观察到类似的结果，表明制备的纳米颗粒体系具有有效缓解缺氧的潜力，最终可以提高O2依赖疗法在癌症治疗中的治疗效率。
体外细胞治疗效果
采用活细胞/死细胞分离和MTT法研究体外细胞治疗效果。从图中可以看出，无论是否有激光照射，PBS处理的细胞都能观察到最鲜艳的绿色荧光，说明无论是PBS还是激光都不会产生明显的负面影响。在这些条件下，记录到非常小的红绿荧光强度比(R/G)。结果与MTT结果一致，在这些情况下，95%以上的细胞在常氧或缺氧下仍然存活。在ICG/MOF/DNA组中，在常氧条件下，激光照射细胞时发现部分红色荧光，R/G比值增加。从MTT结果来看，细胞存活率从94.43%下降到62.31%，说明激光诱导的PTT/PDT导致了部分细胞死亡。当HepG2细胞暴露于ICG/MOF/DNA-Dox或ICG-PFH/MOF/DNA-Dox时，由于ATP触发的CT程序，观察到相似的R/G比率和细胞存活率。引入激光后，PTT/PDT/CT在ATP和激光刺激方面使大量细胞失活，R/G比较高，细胞存活率较低，分别为28.21%和17.69%。相比之下，在缺氧条件下，ICG/MOF/DNA和ICG/MOF/DNA- Dox辐照处理的细胞存活率分别为64.46%和41.73%，高于正常缺氧条件下相应组的62.31%和28.21%，证实由于缺氧，ICG上的PDT过程计数受到限制。然而，近红外照射下，缺氧条件下ICG-PFH/MOF/DNA-Dox处理的细胞存活率仅为17.46%，接近正氧组(17.69%)，甚至低于正氧条件下ICG/MOF/DNA-Dox/NIR处理的细胞存活率(28.21%)，提示引入PFH可以有效缓解缺氧情况，提高治疗效果.流式细胞术数据进一步验证了PFH的作用。在纳米平台中引入PFH后，在缺氧条件下细胞凋亡明显增强。此外，4T1细胞的活死染色/MTT实验结果与HepG2细胞的结果一致，进一步表明NIR和ICG-PFH/MOF/DNA-Dox的作用在常氧或缺氧环境下都能达到强大的细胞治疗效果。对于正常细胞，即使在常氧条件下，同样的处理也能使80%以上的细胞存活。这种明显的差异可能归因于AS1411适体，它可以有效地靶向癌细胞而不是正常细胞。因此，很少的ICG-PFH/MOF/DNA-Dox进入正常细胞，导致低细胞毒性。
ICG-PFH/MOF/DNA-Dox的体内抗肿瘤作用
基于已证实的体外细胞治疗效果，在HepG2荷瘤小鼠体内探讨ICG-PFH/MOF/DNA-Dox对肿瘤的治疗作用。在此之前，我们研究了不同浓度的激光照射ICG-PFH/MOF/DNA-Dox对HePG2细胞和L-02细胞的MTT测定。ICG-PFH/MOF/DNA-Dox的最佳浓度为200µg/mL，显示出令人满意的癌细胞杀伤效果(>80%)，同时对正常细胞仍保持可接受的副作用(细胞存活率约为75%)。首先，通过记录静脉注射ICG-PFH/MOF/DNA-Dox前后ICG的NIR-I荧光来评估纳米系统的体内靶向能力。以不含AS1411的纳米探针ICG-PFH/MOF/DNAATP-Dox作为对照。ICG-PFH/MOF/DNA-Dox处理组，早在2 h就能监测到肿瘤部位微弱的荧光信号，注射后4 h肿瘤部位检测到明显的荧光信号，即使保留时间长达24 h，仍能清晰地监测到荧光信号。而对照组，注射后4 h肿瘤组织仍能监测到微弱的荧光信号。在12 h时增强，24 h时衰减。通过对不同时间荧光强度的半定量可以清楚地了解到这一发现。与ICG-PFH/MOF/DNA-Dox处理小鼠相比，ICG-PFH/MOF/DNAATP-Dox处理小鼠的前12 h全身荧光信号相对较高，说明AS1411适体可以帮助纳米系统快速有效地在肿瘤部位积累，并长期保持肿瘤。为了更好地表征纳米探针的生物分布，在注射后24小时采集肿瘤和主要器官并进行成像。由此可见，ICG-PFH/MOF/DNA-Dox处理小鼠的肿瘤组织中仍出现较强的荧光信号，并有预期的肝脏积累。而ICG-PFH/MOF/ DNAATP-Dox处理小鼠肿瘤的荧光信号较弱。结果与肿瘤和器官记录的荧光强度一致。由于ICG-PFH/MOF/DNA-Dox在肿瘤组织中的大量积累，人们努力将这些纳米探针用于体内肿瘤治疗。将HepG2荷瘤小鼠随机分为5组(n = 3)，分别给予PBS、MOF/DNA-Dox、ICG/MOF/DNA +激光、ICG/MOF/DNA-Dox +激光和ICG-PFH/MOF/DNA-Dox +激光治疗。根据NIR-I荧光成像数据，ICG-PFH/MOF/DNA-Dox在4 h时在肿瘤中表现出相对较高的积累。样品静脉注射4 h后，用808 nm激光照射肿瘤。大鼠每2 min进行一次热像图，总时间为10 min。激光照射肿瘤区域对PBS处理组的影响可以忽略不计，而ICG-PFH/MOF/DNA-Dox处理组的温度从37.4℃升高到54.0℃。为了证实ICG-PFH/MOF/ DNA-Dox与PTT/PDT/CT的有效协同作用，对上述小鼠进行了为期两周的治疗。监测各组肿瘤体积相对于初始体积的相对变化。由于缺乏治疗，PBS治疗组监测到肿瘤快速生长。MOF/DNA- Dox激光的个体CT、ICG/MOF/DNA +激光的PTT/PDT、ICG/MOF/DNA-Dox +激光的PTT/PDT/CT均有一定的抑制作用，但仍未能抑制肿瘤生长。值得注意的是，终点重量最小和体积最小的ICG-PFH/MOF/DNA-Dox+激光治疗组具有明显的抑制作用和体积减小，表明单纳米颗粒体系中PFH辅助PTT/PDT/CT可以显著提高抗肿瘤效率。值得一提的是，在所有测试组中没有出现明显的体重波动，表明所使用探针的全身毒性较低。此外，收集的肿瘤用苏木精和伊红(H&E)染色进行肿瘤内组织学评估。与其他治疗组相比，激光照射下ICG-PFH/MOF/DNA- Dox治疗组坏死面积最大。这些数据表明，ICG-PFH/MOF/DNA-Dox具有靶向性、长期蓄积和保留能力，对肿瘤具有强大的协同光化疗作用，副作用小。
结论
通过将ICG和PFH嵌入UiO MOF中，通过点击化学反应介导的功能编码dsDNA修饰，构建了ICG-PFH/MOF/DNA-Dox纳米体系。ICG-PFH/MOF/DNA-Dox可通过核蛋白受体与AS1411适体的特异性亲和性揭示肿瘤的活性靶向作用，然后通过ATP触发的线粒体内Dox释放实现CT。进一步暴露在808 nm激光下，ICG-PFH/MOF/DNA-Dox可以同时实现ICG介导的PTT和PDT。在PTT热的情况下，共负载PFH通过释放O2来调节缺氧的肿瘤微环境，以增强PDT和CT。此外，部分dsDNA也可以被热熔化，这可以加速Dox的释放，从而实现增强CT。利用ICG在NIR-I窗口的成像性能，制备的ICG-PFH/MOF/DNA-Dox最终在体外和体内揭示了活性靶向、NIR-I成像以及ATP和NIR控制的肿瘤PTT/PDT/CT协同和增强作用。
参考文献
Nucleic acid-MOF nanoparticle conjugates for NIR/ATP-driven synergetic photo-chemotherapy with hypoxia relief ，Xiaodong Lin , Haotian Wu , Jing Zhang , Xiying Chen , Xia Gao * , Yaqing Liu * ，Chemical Engineering Journal 480 (2024) 147865，https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.147865
