内容提要
免疫原性细胞死亡（ICD）是一种通过诱导抗肿瘤免疫应答来增强肿瘤治疗效果的有前途的方法。然而，目前的ICD诱导剂通常具有不足的内质网（ER）富集和在由ER-线粒体相互作用引起的肿瘤免疫逃逸中无效。本研究开发了一种可光激活的探针THTTPy-PTSA，它可以顺序靶向ER和线粒体。THTTPy-PTSA结合了用于ER靶向的对甲苯磺酰胺（PTSA），并且在光照射下，四氢吡啶基团经历光氧化脱氢反应，转化为充当靶向部分的吡啶鎓基团。结果表明，THTTPy-PTSA在光照射处理后表现出异常的从ER到线粒体的亚细胞易位，随后通过级联放大效应触发更强的ER应激反应。重要的是，增强的ER应激通过引发许多损伤相关分子模式的释放，从而诱导明显和广泛的ICD，从而增强抗肿瘤免疫功效，从而在4 T1肿瘤模型中产生实质性治疗功效。总的来说，这些发现强调了光动力学调节ER-线粒体网络的关键作用，THTTPy-PTSA通过精确的空间和时间调节促进了有效支持抗肿瘤免疫反应。这种创新的方法为解决与癌症免疫治疗相关的挑战提供了一种有前途的替代方案。
结果与讨论
THTTPy-PTSA的合成与表征
设计并制备了THTTPy-PTSA探针，用于以PTSA基团作为靶向部分特异性靶向ER，而制备了含有吡啶部分的TTPy-PTSA探针，用于靶向ER。该合成路线起始于4-甲苯磺酰氯和3-溴丙胺之间的反应，得到化合物2a，其随后与4-甲基吡啶反应得到化合物2b。化合物2b与5-（4-二苯胺苯基）噻吩-2-甲醛进一步缩合最终形成TTPy-PTSA，然后使用硼氢化钠（NaBH 4）对其进行还原以产生THTTPy-PTSA。通过NMR和HRMS分析充分表征了THTTPyPTSA和TTPy-PTSA的结构。我们研究了THTTPy-PTSA和TTPy-PTSA的光物理性质。THTTPy-PTSA在各种有机溶剂中在390 nm处表现出特征最大吸收，而在水性环境中，观察到在约400 nm处的降低和红移增宽吸收，这可能归因于由于THTTPy-PTSA有限的水溶性而在水溶液中形成纳米聚集体。此外，THTTPy-PTSA的光致发光（PL）光谱显示，随着溶剂极性的降低，发射蓝移和增加。这种行为通过发射波长从481 nm蓝移到443 nm得到证实，伴随着DMSO/甲苯混合物中近1.5倍的增强，甲苯分数从10%增加到99%。THTTPy-PTSA的极性敏感发射是合理的，通过调用分子内电荷转移效应，与三苯胺噻吩部分作为电子供体和四氢吡啶部分作为弱电子受体。随后，对TTPy-PTSA的光物理性质进行了研究。TTPy-PTSA在λ 485 nm处表现出最大吸收，并显示出极性敏感性发射，其特征在于响应于溶剂极性降低而发生蓝移和发射强度增加。该现象进一步通过发射的显著蓝移（范围从773至654 nm）来强调，随着甲苯分数从10%增加至99%，DMSO/甲苯混合物中的发射强度增加了1056.7倍。类似于THTTPy-PTSA，TTPy-PTSA也表现出极性敏感的发射行为，由于分子内电荷转移效应，三苯胺-噻吩部分作为电子供体和吡啶部分，具有显着的正电荷，作为强电子受体。
我们在1%DMSO/水混合物中在光照射（405 nm，20 mW cm-2）下检查了从THTTPy-PTSA到TTPy-PTSA的光活化转化。以辐射-时间依赖性方式分别观察到在390 nm（对应于THTTPyPTSA的最大吸收波长）处吸收的逐渐降低和在485 nm（对应于TTPyPTSA的最大吸收波长）处吸收的连续增加，表明从THTTPy-PTSA到TTPy-PTSA的光氧化脱氢转化过程。这种吸收光谱的动态演变强调了在光照射下溶液中THTTPy-PTSA的化学结构发生的转变，表明从THTTPyPTSA到TTPy-PTSA的光活化转变。为了进一步证明THTTPy-PTSA的光活化转化，我们在1%DMSO/甲苯溶液中进行了光照射下的PL光谱。随着曝光时间的增加，462 nm处的PL强度（对应于THTTPyPTSA的最大发射波长）逐渐下降，而644 nm处的PL强度，（对应于TTPy-PTSA的最大发射波长）逐渐增强的定量结果，突出了TTPy-PTSA的产生。在光照射之前和之后，进一步支持了向TTPy-PTSA的光氧化转化。鉴于THTTPy-PTSA的显着的光活化转化能力，我们的调查，从而转移到评估THTTPy-PTSA和TTPy-PTSA的光动力活性的焦点。值得注意的是，THTTPy-PTSA表现出与I型光敏剂一致的特征，在光照射下有效地产生羟基自由基和超氧阴离子，如通过利用羟苯基荧光素（HPF）和二氢乙锭（DHE）作为阳性对照所证实的。相比之下，TTPy-PTSA表现出更宽的活性谱，作为I型和II型光敏剂，有效地产生羟基自由基，超氧阴离子和单线态氧。使用HPF、DHE和单线态氧传感器绿色（SOSG）作为各自的指示剂证实了这种多方面的活性。
靶向内质网和线粒体的THTTPy-PTSA体外诱导显著的内质网应激-线粒体损伤
考虑到上述因素，我们对THTTPy-PTSA在鼠三阴性乳腺癌细胞系（4 T1）中的光活化转化行为和亚细胞定位进行了全面检查。在THTTPy-PTSA的情况下，在光照射条件下细胞摄取后，观察到荧光从绿色向红色的显著和渐进性变化，与图中的荧光光谱结果一致。在没有光照射的情况下，THTTPy-PTSA在30分钟内选择性地积累在内质网中，这通过用具有0.92的高共定位系数的商业染料ER-示踪剂红共染色来验证，如通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像所揭示的，表明THTTPy-PTSA在光照射之前具有特异性ER靶向能力。根据先前的文献，靶向ER可能改变ER的平衡并触发ER应激，从而促进更多DAMP的产生以诱导ICD。因此，我们随后探索了THTTPy-PTSA的ER靶向能力是否确实可以激发ER应激。我们检测了PERK和eIF 2β的表达水平，两者都是ER应激传感器在解折叠蛋白反应中的关键生物标志物。如预期的，当4 T1细胞经受不同浓度的THTTPy-PTSA 12小时时，磷酸化PERK和eIF 2β的表达以剂量依赖性方式显著增加。同样地，当用25 μ π ι的一致浓度处理不同时间时，磷酸化PERK和eIF 2β的表达也以时间依赖性方式增加，表明THTTPy-PTSA可以特异性靶向ER，从而引发显著的ER应激。鉴于ER应激与其对钙稳态的破坏之间已建立的联系，我们使用Fluo-3 AM（一种专为Ca2+检测而设计的细胞渗透性荧光染料）同时测量细胞内Ca2+水平。值得注意的是，THTTPy-PTSA诱导4 T1细胞中细胞内游离Ca2+的明显升高，进一步验证了其诱导ER应激的有效能力。特别令人感兴趣的是，观察到在光照射处理（405 nm，20 mW cm-2，2 min）后，由THTTPy-PTSA施加的ER应力强烈增强。当暴露于THTTPy-PTSA时，4 T1癌细胞的细胞活力在光照射后在25 μ π ι的浓度下显著降低至41.0%，这表明THTTPy-PTSA具有优异的光动力学抗肿瘤活性。为了深入了解光辐射介导的内质网应激，我们首先对THTTPy-PTSA在光辐射后的亚细胞定位进行了研究。CLSM成像显示，THTTPy-PTSA的荧光由绿色转变为红色，并主要聚集在线粒体中，共定位系数为0.93，这一点与Mito-tracker绿色共染色得到了证实。这些结果表明，THTTPy-PTSA在光照处理后显示出从ER到线粒体的智能亚细胞移位能力，随后引起更强的ER应激。为了探讨内质网应激-线粒体损伤诱导的细胞凋亡机制，我们进行了光照射或不照射后THTTPy-PTSA处理后凋亡相关蛋白的蛋白质印迹，包括CHOP，一种在内质网应激后过表达的促凋亡蛋白，和caspase 3，一种与线粒体凋亡密切相关的蛋白。结果表明，THTTPy-PTSA在光照射后诱导CHOP和切割的半胱天冬酶3的显著上调，从而进一步验证了其诱导癌细胞凋亡的有效能力。在验证了THTTPy-PTSA在暴露于光照射时的线粒体锚定之后，我们然后分别使用DCF-DA和Mito SOX绿色线粒体过氧化物作为指示剂来研究THTTPy-PTSA是否可以在4 T1癌细胞内产生ROS，包括细胞总ROS和细胞产生的ROS。与未经光照射处理的THTTPyPTSA相比（THTTPy-PTSA（-L））、THTTPy-PTSA（+L）均能显著增加细胞内总活性氧和光刺激产生的活性氧，表明THTTPy-PTSA（+L）诱导4 T1癌细胞中ROS升高主要是由于ROS产生的ROS，与光照射驱动的THTTPy-PTSA靶向特性一致。值得注意的是，自由基清除剂N乙酰半胱氨酸（NAC）和Mito-TEMPO（总ROS和线粒体ROS的两种抑制剂）均显著降低了ROS升高效应，进一步支持了线粒体产生的ROS是ROS主要来源的结论。为了进一步验证THTTPy-PTSA（+L）对线粒体的作用，我们使用JC-1试剂盒对线粒体膜电位（MMP）进行染色，结果显示THTTPy-PTSA在光照射后诱导线粒体膜电位显著降低，与CCCP（一种强大的线粒体氧化磷酸化解耦剂）的作用相当，与上述THTTPy-PTSA（+L）介导的线粒体氧化应激的结果一致。一个合理的解释是，ER靶向产生ROS有助于ER应激，其在光照射后传递到线粒体并引起线粒体损伤。大量的细胞产生的ROS与ER相互作用，进一步加重ER应激。以上结果表明，THTTPy-PTSA可诱导光照射后线粒体损伤和内质网应激，激活PERK介导的eIF 2信号通路，下调MFN-2的表达。这些结果阐明了THTTPy-PTSA（+L）作为癌症治疗的治疗剂的潜力。
THTTPy-PTSA诱导的体外CRT暴露、HMGB 1和ATP释放
基于上述结果，我们接下来通过癌细胞表面上的ecto-CRT的免疫染色分析和流式细胞仪分析来研究我们的THTTPy-PTSA是否可以大量诱导ICD，这被认为是评估ICD诱导的金标准。具体地，在37 ℃下用THTTPy-PTSA（25 μm）处理4 T1细胞90分钟，然后暴露于光（20 mW cm-2）2分钟，并继续孵育12小时。金丝桃素，一种II型ICD光动力诱导剂，作为ER靶向药物的阳性对照。与金丝桃素类似，与单独的“THTTPy-PTSA（-L）“处理相比，在“THTTPy-PTSA（+L）”组中更多的外-CRT从细胞质迁移到细胞表面。此外，用THTTPy-PTSA处理的细胞显示出以浓度依赖性方式的显著CRT上调，这通过流式细胞术分析和定量分析验证。除了外CRT，HMGB 1从细胞核迁移到细胞质，从而释放到细胞外作为ICD的另一个标志。在用光照射进行THTTPy-PTSA处理后，HMGB 1（红色荧光）显著释放到细胞外空间中，这通过CLSM成像和蛋白质印迹法两者来验证。为了进一步证明THTTPy-PTSA光照射诱导癌细胞释放HMGB 1，我们用ELISA试剂盒检测了4 T1细胞的细胞外HMGB 1释放水平，结果表明，THTTPy-PTSA光照射后，HMGB 1显著释放到细胞外上清液中，与CLSM成像图3C和蛋白质印迹的结果一致。最值得注意的是，THTTPy-PTSA（+L）组中的CRT翻译和HMGB 1释放强于多柔比星（命名为DOX）组，表明THTTPy-PTSA优异的ICD诱导能力。除CRT暴露和HMGB 1释放外，还检测到细胞外ATP释放。将4 T1细胞与THTTPy-PTSA（25 μm）和金丝桃素（4 μm）共同孵育24 h，收集上清液，用ATP生物发光检测试剂盒分析。与PBS相比，THTTPy-PTSA增加了ATP分泌，在不存在或存在光的情况下，相对ATP释放速率分别为1.43倍和3.16倍，进一步支持了以下结论：THTTPy-PTSA与光照射可以有效诱导ICD相关DAMP的表达。由于垂死的肿瘤细胞也释放热休克蛋白作为DAMP，我们还应用蛋白质印迹检测Hsp 70的表达，结果显示THTTPy-PTSA用光照射处理显著诱导Hsp 70释放到细胞外上清液中，进一步验证了THTTPy-PTSA可以有效诱导ICD相关DAMP的释放。此外，为了进一步研究ROS在THTTPy-PTSA诱导的ICD相关DAMP中的作用，我们分别用THTTPy-PTSA、NAC和Mito-TEMPO共同处理4 T1细胞。NAC和Mito-TEMPO均显著抑制由THTTPy-PTSA（+L）引起的外-CRT的上调，证明由THTTPy-PTSA（+L）处理产生的由NACA产生的ROS有益于ICD诱导。这一结果进一步证实了ROS诱导的线粒体应激在大规模诱发ICD中的重要性。这些数据共同表明，由于线粒体特异性靶向和癌细胞线粒体中显著的ROS产生，THTTPy-PTSA是先进的ICD诱导剂。总的来说，上述结果表明，光照射处理的THTTPy-PTSA导致强烈的ER应激和随后的DAMP如CRT、HMGB 1和细胞外ATP的释放，从而放大了ICD诱导。
THTTPy-PTSA体外有效激活免疫应答
鉴于树突状细胞（DC）作为抗原呈递细胞（APC）的主要类型，负责识别DAMP并促进其成熟以激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL），接下来通过骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）-癌细胞共培养试验研究了由THTTPy-PTSA触发的ICD介导的DC成熟。具体地，在用THTTPy-PTSA处理12小时后，然后将4 T1细胞与DC再共孵育24小时，并使用流式细胞术评估DC成熟标志物的表达。“THTTPy-PTSA（+L）”组诱导30.3%的成熟DC（CD 86 + CD 80+），其分别比“PBS”组（15.3%）、“THTTPy-PTSA（-L）”组（23.5%）和“金丝桃素”组（23.6%）高1.98倍、1.29倍和1.28倍。此外，我们还进行了transwell实验来评估DC的迁移能力。与流式细胞术揭示的DC活化实验结果一致，“THTTPy-PTSA（+L）”组的DC迁移能力显著增强，进一步证明THTTPy-PTSA在光照射后可诱导DC成熟和迁移。为了进一步证明，还检测了成熟DC表面表达的共刺激分子（CD 40、CD 80和CD 86）。与不存在光照射相比，在光照射后用THTTPy-PTSA随后处理4 T1细胞导致CD 40（1.38倍）和CD 86（1.62倍）表达水平的显著上调。此外，发现THTTPy-PTSA处理刺激肿瘤坏死因子α（TNF-α）（与DC成熟相关的必需免疫细胞因子）的分泌，其中THTTPy-PTSA（+L）组显示出比THTTPy-PTSA（-L）组高1.44倍的表达水平。这些结果表明，THTTPy-PTSA与光照射处理的癌细胞作为一种新的ER和靶向ICD诱导剂可以有效地激活免疫反应在体外。
结论
我们已经研究了一种新型的光活化ER-线粒体顺序靶向探针THTTPyPTSA在解决肿瘤免疫逃逸挑战中的功效。THTTPy-PTSA利用对甲苯磺酰胺（PTSA）靶向ER，在光照射下表现出依次靶向ER和线粒体的能力。随后从ER到线粒体的易位诱导级联放大效应，导致强烈的ER应激反应和线粒体损伤以产生ROS，并激活PERK介导的eIF 2β磷酸化信号通路以引起Ca2+流出。值得注意的是，THTTPyPTSA在4 T1肿瘤模型中表现出异常的亚细胞易位，并表现出治疗效果，这是由更强的ER应激反应和随后的适应性免疫反应激活介导的。此外，THTTPy-PTSA对ER和线粒体的双重氧化应激通过表现出I型和II型ICD诱导剂的特征来促进免疫原性细胞死亡，导致DAMP的释放增加和树突状细胞成熟。在4 T1肿瘤疫苗模型中，THTTPy-PTSA增强了CD 8 + T细胞和NK细胞向肿瘤微环境中的浸润，同时抑制了Treg细胞的表达，从而显著抑制了肿瘤生长。我们的研究结果强调了THTTPy-PTSA作为一种有前途的治疗策略的潜力，采用空间和时间调节ER-线粒体网络并增强抗肿瘤免疫应答。
参考文献
Photodynamic Modulation of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Network Boosted Cancer Immunotherapy，Xiaoli Wang, Jieying Qian, Zhenyu Yang, Yang Song, Wenping Pan, Yayi Ye, Xiaohua Qin, Xianwu Yan, Xiaowan Huang, Xingwu Wang,* Meng Gao,* and Yunjiao Zhang*，Adv. Mater. 2023, 2310964，https://doi.org/10.1002/adma.202310964
