内容提要
由于肿瘤细胞对光敏剂的吸收增强，靶向光动力疗法(TPDT)被认为优于传统的光动力疗法。本文将三肽Arg-Gly-Asp (RGD)沿轴向共价连接到硅酞菁上，合成了一种两亲性不对称环-Arg-Gly-Asp-d-Tyr-Lys (cRGDyK)共轭硅酞菁(RSP)，用于三阴性乳腺癌(TNBC)的TPDT治疗。RSP作为生理缓冲液中的单体进行了光谱表征。与此同时，RGD修饰RSP后，在过表达ανβ3整合素受体结合RGD的TNBC细胞中光敏剂大量积累，大大降低了光毒性风险。体外光动力学实验表明，RSP在4T1细胞系中的IC50值为295.96 nM，引起肿瘤细胞明显凋亡。RSP对小鼠原位TNBC的抑瘤率达到74%，而非靶向光敏剂对肿瘤无明显抑制作用。综上所述，这种新型靶向酞菁硅合成路线简单、靶向性强、TPDT治疗TNBC疗效高，具有良好的临床转译潜力。
结果与讨论
分子设计考虑和模拟
靶向光敏剂设计的基本原则是在保证体内肿瘤靶向性和细胞亲和性的同时，有效减少光敏剂聚集。我们用cRGDyK对硅酞菁的一端进行轴向修饰，得到了两亲性、不对称靶向的光敏剂。为了尽可能检验分子设计的合理性和可行性，我们模拟了RSP的最低能量构象。作为对照，我们也模拟了侧面有cRGDyK修饰的酞菁锌的分子状态。从结果可以看出，由于轴向修饰的两个苯环的存在，使得RSP的酞菁分子的大环面分离得很好。也可以看出，cRGDyK分子的识别位点暴露良好，保证了其靶向能力。然而，酞菁锌的分子平面大环完全暴露，导致H型聚集体的形成，降低了荧光和单重态氧的产率。分子模拟的结果进一步证实了本文设计的分子在水溶液中不易聚集，因此比非轴向修饰的酞菁锌具有更强的适用性。
合成与表征
RSP的合成路线。首先，我们以容易获得的1,3-二亚氨基异吲哚和四氯化硅为原料合成了二氯化硅酞菁。然后，在碱性条件下用对羟基苯基丙酸轴向取代二氯化硅酞菁，得到具有两个游离羧基的有机硅酞菁(SC, 化合物2)。最后，将RGD靶向基团偶联到酞菁上。为了避免cRGDyK分子的自环化和两端修饰分子的形成，首先用活化酯激活SC的一个羧基。羧基活化后，在室温下严格控制cRGDyK与SC的比例(1:3)进行简单的酰胺缩合反应，初步得到cRGDyK取代的硅酞菁(RSP, 化合物3)。SC和RSP的结构通过NMR和MS进行了验证。
由于其两亲性，RSP在纯水中溶解度有限，而在含有1% Cremophor EL (CEL)的水溶液中溶解度良好。因此，我们将RSP溶解于含有1% CEL的生理盐水、含有0.05% CEL的DMEM培养基和DMF(作为对照)中，测量其吸收光谱和荧光光谱。从吸收光谱可以看出，RSP在含1% CEL的生理盐水和含0.05% CEL的DMEM介质中仍保持单体状态，与DMF中的吸收光谱几乎完全重合，Q波段吸收峰尖锐。RSP在生理盐水中的荧光强度高于有机溶剂DMF，而在DMEM中的荧光强度与DMF相似。RSP具有在生理盐水和细胞培养基中不聚集的特点，为进一步研究其光毒性提供了基础。
为了更好地模拟光敏分子在实际应用中的情况，我们测量了RSP在含1% CEL的生理盐水中的单线态产氧量。RSP和SC的斜率分别为0.06481和0.07165 。可以看出，cRGDyK的引入对光敏分子的单线态产氧率没有明显影响，由于位阻的影响，仅降低了10%，这可能对氧与酞菁的反应有轻微影响。进一步测定了RSP的光稳定性。可以看出，辐照4min后，RSP在最大吸收波长处的吸光度仅略有下降，仍保持在原来的80%左右。RSP的轴向修饰有助于提高酞菁母环在单线态氧生成时的稳定性，使其不易降解。光稳定性研究结果表明，RSP具有优良的光稳定性，适合长期储存。
细胞摄取和亚细胞共定位
为了评估RSP的细胞摄取，我们将RSP和SC(非靶向对照)与三阴性乳腺(4T1)癌细胞孵。我们观察到癌细胞4T1的摄取具有时间依赖性，在24 h后达到最大值，RSP的强度比SC高2倍，表明cRGDyK可以有效增加psp的细胞摄取。RSP孵育4小时后，进行共聚焦成像，绘制4T1癌细胞内RSP和SC的分布。SC和RSP的分布位置与溶酶体大致重合。通过剖宫图可以进一步分析共定位情况。通过分析全图的Pearson共定位系数， RSP的溶酶体共定位指数(0.78)优于SC(0.38)，说明RSP能够更好地定位到溶酶体上。
体外药代动力学和光动力治疗
通过不同浓度的4T1癌细胞孵育，将其与PBS单独孵育、光单独孵育(L)、SC、RSP、SC +光孵育(SCL)和RSP +光孵育(RSPL) 5组进行比较，检测RSP的杀癌能力。在无光照条件下，4T1癌细胞的细胞活力没有明显下降。然而，RSP和SC的光杀伤能力在0 ~ 2 μm范围内表现出明显的浓度依赖性。与SC组相比，RSP组在光照射下的杀伤效果较低(λ > 610 nm, 48 J/cm2)，这与单线态氧产率一致。然后用流式细胞术对TPDT后4T1细胞的凋亡、坏死和活细胞进行计数，与SC相比，RSP孵育后的细胞凋亡率提高了9.73%，这些实验结果表明基于RSP的TPDT可以有效提高PDT的治疗效果。
理想的靶向光敏剂应该能够在肿瘤部位快速积累，并在注射后从正常器官代谢。RSP药代动力学研究显示，血浆半衰期为45.22 min，消除半衰期为463.02 min。分别在RSP注射24、48、120 h后，解剖小鼠主要脏器并测定其荧光定量。我们发现RSP主要通过肝脏和肾脏代谢出体外。注射120 h后，RSP已完全代谢出体外，未检测到明显荧光信号。这些结果表明，RSP具有快速的血浆清除率，48 h内可代谢90%以上的RSP。长期观察也表明，RSP在器官内没有特异性积累的倾向，表明RSP不具有潜在的光毒性。
体内肿瘤靶向和光动力治疗
建立三阴性乳腺癌原位和皮下小鼠模型，通过肿瘤显像实验研究RSP的体内肿瘤靶向作用。在皮下肿瘤模型中，尾静脉注射后，RSP和SC的荧光信号随时间逐渐增强。RSP在0.5 h内出现肿瘤积聚，随后信号继续增强，在注射后6 h达到峰值。我们发现RSP的肿瘤靶向性明显优于SC，注射24 h后，RSP肿瘤部位的荧光强度比SC高2.5倍。为了研究器官的沉积途径，注射24 h后，在荧光成像系统中对器官进行肢解和检查，有或没有靶向修饰。很明显，RSP和SC的肿瘤分布有显著差异，半定量分析显示，RSP在肿瘤部位的荧光信号比SC高4倍。与SC相比，原位肿瘤模型中RSP的积累更多。体内肿瘤成像结果表明，RSP具有良好的肿瘤靶向性，可在肿瘤内停留24小时。
令人鼓舞的荧光成像结果激励我们进一步研究RSP在4T1荷瘤小鼠体内的光动力作用。RSPL组肿瘤得到有效抑制，肿瘤体积仅为对照组的35.7%。PBS、Light、SC、RSP组肿瘤体积差异无统计学意义。各组小鼠体重变化不明显。治疗结束时，对各组小鼠的肿瘤进行称重。与PBS组相比，RSPL组的肿瘤抑制率达到74%，而SC-light组的肿瘤细胞增殖未受到明显抑制。
通过对肿瘤部位的H&E染色和TUNEL染色分析，RSPL组肿瘤细胞切片显示出较强的绿色荧光信号，表明肿瘤细胞凋亡率高，加速抑制肿瘤生长。SCL (SC + Light)组仅显示微弱的绿色荧光，表明RSP在体内的靶向性比SC好得多。通过对组织荧光信号的定量分析，发现RSPL组的细胞凋亡是SCL组的两倍。提示TPDT可诱导细胞额外凋亡。Ki67免疫组化染色显示RSPL组能显著抑制肿瘤生长，其余组全野呈棕色阳性标记，肿瘤细胞增殖非常旺盛。从定量分析结果可以看出，RSPL组的Ki67增殖信号仅为PBS对照组的10%，为SCL组的1/4，这也强烈说明TPDT比非靶向PDT更能充分抑制肿瘤细胞的增殖。为了更好地评价TPDT的安全性，取不同给药组小鼠的主要脏器，H&E染色进行病理分析。可见心、肝、脾、肺、肾的H&E切片未见明显病理现象。这说明在治疗过程中注射RSP和激光照射对机体没有产生毒副作用，进一步证明了使用RSP进行TPDT是安全的。
随着光动力疗法向临床转化的发展，更精确的光敏剂富集成为必要。靶向修饰PS以增加肿瘤部位光敏剂的峰值浓度是目前的研究热点。靶向修饰小分子药物的主要方法是抗体-药物偶联(ADC)。ADC可以通过高度特异性的抗体受体特异性识别，将药物精确地输送到肿瘤细胞中。在增强肿瘤细胞摄取的同时，减少正常细胞对光敏剂的非特异性摄取。此外，小尺寸的纳米抗体已被证明可以提高药物的靶向能力。然而，抗体的大尺寸限制了它们对肿瘤的渗透，高成本的生产限制了它们在少数临床场所的使用。而利用具有高肿瘤特异性的小分子肽对药物进行修饰，可以在降低生产成本的同时提供与抗体药物相当的靶向能力。我们利用靶向肽合成了两亲性和不对称的靶向有机硅酞菁。其分子尺寸越小，穿透能力越好。靶向修饰的成本显著降低，更适合大规模合成。因此，RSP比ADC具有更好的临床转化前景。
cRGDyK肽是研究最广泛的一类肿瘤特异性肽。已有大量临床前实验表明，cRGDyK联用显像剂(微泡、磁共振造影剂、荧光素等)可有效提高造影剂对肿瘤成像的敏感性，证实了cRGDyK具有广泛的肿瘤靶向作用。此外，RGD已被广泛用于提高小分子光敏剂或纳米光敏剂的靶向性。先前的研究报道了整合素在一些肿瘤中的过表达，包括三阴性乳腺癌，这导致了用于治疗RGD碱基的分子探针的开发。虽然这些研究用cRGDyK肽修饰酞菁，但仍未能实现成功的临床转译。最重要的原因是水溶性差和合成路线复杂。水溶性差导致酞菁在水溶液中聚集，单线氧产率降低。为了提高水溶性，加入了促进溶解度或抑制光敏剂聚集的药物赋形剂，这给代谢增加了很多不必要的负担。考虑到这些问题，我们对酞菁进行了轴向而非环上的修饰。轴向化学键的形成阻碍了酞菁环之间的相互作用，有效地避免了光敏剂的聚集。此外，RGD不仅作为靶向基团引入，而且作为亲水性基团引入。水溶性的增加进一步减少了酞菁的聚集。cRGDyK分子增强了RSP的靶向性和亲水性，有效解决了酞菁聚集的靶向性问题。
在我们进一步的研究中，我们发现经过RGD轴向改性后，酞菁不仅增加了靶向性，而且显著降低了水溶液中的聚集。在以往的研究中，有机硅酞菁在水溶液中的荧光强度明显低于在有机溶剂中的荧光强度。荧光光谱实验表明，生理条件下RSP缓冲液的荧光强度高于DMF。同时，RSP在含1% CEL的生理盐水中的Q波段吸收峰明显。这些结果表明，RSP在生理缓冲液中以单体形式存在。酞菁的轴向改性有效地避免了H聚集体和J聚集体的形成。进一步的实验还表明，RSP在生理缓冲液中表现出良好的单线态产氧量和光稳定性。RGD的修饰导致三阴性乳腺癌细胞中光敏剂的大量积累。体外光动力学实验表明，RSP在4T1细胞系中的IC50为295.96 nM，可引起肿瘤细胞明显凋亡。RSP对原位小鼠体内三阴性乳腺癌肿瘤有较高的抑瘤率。此外，RSP的循环半衰期约为45分钟，可被肝脏和肾脏代谢。综上所述，RSP的肿瘤靶向性优于非靶向有机硅酞菁，能够更有效地抑制肿瘤生长。
与非靶向光敏剂相比，RSP在提高三阴性乳腺癌的光动力治疗效果方面显示出很大的希望。在体内和体外实验中，与非靶向有机硅酞菁相比，靶向光敏剂RSP在三阴性乳腺癌中表现出更好的比较靶向性和肿瘤抑制作用。尽管单克隆抗体仍然是靶向治疗的主流，但它们的大尺寸限制了它们对肿瘤的渗透，高生产成本限制了它们在少数临床中心的使用。然而，像RSP这样的小分子药物，可以廉价地大规模合成，代表了有前途的下一代PDT模式。我们的工作解决了当前的研究需求，并且肯定将有助于扩大目前有限的PDT癌症治疗范围。基于RSP，有机硅酞菁不仅可以与cRGDyK偶联，还可以根据不同的肿瘤类型用不同的多肽替代，实现对不同类型肿瘤的光动力治疗。此外，它可以连接不同的成像造影剂，如MRI造影剂，SPECT造影剂，实现冲击引导光动力治疗，使其成为治疗学的多功能分子。
总结
综上所述，我们证明RGD在RSP中的共价连锁可以有效增强表达整合素的肿瘤细胞的摄取，从而提高PDT的效率。在生理缓冲液中，该光敏剂RSP具有优异的荧光特性和单线态产氧性能，并且在光照下具有很高的稳定性。在体内和体外实验中，与非靶向有机硅酞菁相比，靶向光敏剂RSP在三阴性乳腺癌中表现出更好的比较靶向性和肿瘤抑制作用。因此，本文合成的靶向酞菁硅合成路线简单，靶向性强，光敏性高，具有很强的转化应用前景。我们正在努力评估我们的小分子探针在临床成像和治疗中的功效。我们期望这些药物的成功开发将扩大目前有限的癌症治疗范围。
参考文献
Asymmetric, amphiphilic RGD conjugated phthalocyanine for targeted photodynamic therapy of triple negative breast cancer.Rui Li , Yiming Zhou , Yijia Liu , Xingpeng Jiang , Wenong Zeng , Zhuoran Gong , Gang Zheng, Desheng Sun and Zhifei Dai,Signal Transduction and Targeted Therapy (2022)7:64,https://doi.org/10.1038/s41392-022-00906-2
