内容提要
本项目设计了线粒体靶向近红外ii (NIR-II)光敏剂(ps)，通过多重PCD激活实现有效的乳腺肿瘤消除。优化后的PS (DTNI)具有聚集诱导的NIR-II发射特性(>1035 nm)和强大的光动力和光热活性。精确的线粒体靶向能力使DTNI通过线粒体呼吸链扰动发挥化疗活性。机制研究表明，DTNI介导的化疗通过抑制GPX4、上调磷酸化RIPK3/MLKL和激活p53，引发铁坏死、坏死和细胞凋亡。635 nm激光照射下，活性氧物质风暴加剧线粒体功能障碍，放大乳腺癌细胞的铁死亡、坏死和凋亡。协同PCD作用引发了强大的免疫原性细胞死亡，将局部肿瘤消融与全身抗肿瘤免疫连接起来。工程DTNI纳米颗粒实现了肿瘤病变的高对比度NIR-II荧光和光热成像，允许通过化疗，光和免疫治疗精确成像引导根除三阴性乳腺肿瘤。
结果与讨论
分子设计与光物理性质研究
通过保留吸电子的1-乙基-2,3,3-，设计了3种阳离子ps(包括DTNI、((E)-2-(4-(6-(二聚氨基)萘-2-基)苯乙烯基)-1-乙基-3、(E)-2-(2-(5-(6-(二聚氨基)萘-2-基)噻吩-2-基)乙烯基)-1-乙基-3、3-二甲基- 3h -吲哚-1-ium -(DTNTI)) 三甲基- 3h -吲哚核，同时系统地修饰了供电子取代基，以优化光物理性能。提供电子的6-(二对三聚氨基)萘(DTN)基团作为分子转子，通过构象畸变赋予AIE特性，同时通过聚集状态下松散的分子填充实现光热效应。烯基或芳基烯基间隔物的战略性结合可以精确调节π共轭长度和供体- π-受体(D - π- a)相互作用强度，从而产生强烈的NIR-II发射谱，具有不同的化学和光疗活性。二甲亚砜(DMSO)中的ps在549 nm (DTNI)、504 nm (DTNPI)和563 nm (DTNTI)处表现出不同的吸收最大值，相应的摩尔消光系数分别为37,900、22,600和33,900 M−1 cm−1。这些明显可见的吸收带源于分子内电荷转移(ICT)在二对多胺供体和吲哚受体之间的转变。吸收最大值(DTNTI > DTNI > DTNPI)的递进红移与相应给电子体的给电子能力增强相关，强化了D -π-A共轭效应。循环伏安测量证实了这一趋势，得到了与吸收色移一致的最高已占据分子轨道和最低未占据分子轨道能量差分别为1.596 eV (DTNTI)、1.703 eV (DTNI)和1.789 eV (DTNPI)。在不同水体积分数的dmso -水混合物中评价ps的AIE特征(fw)。所有ps在纯DMSO中都表现出微弱的排放。当fw增加到70 vol %(对于DTNPI和DTNTI)和80 vol %(对于DTNI)时，荧光猝灭仍然存在，这归因于主要的ICT效应。升高fw时出现荧光恢复(DTNPI/DTNTI为90 vol %， DTNI为95 vol %)，表明AIE的激活作用。值得注意的是，DTNI表现出典型的溶剂致变色行为，吸收变化可以忽略，但随着溶剂极性的增加，发射红移，证实了其ICT性质。在fw处99%的吸收光谱显示典型的Mie散射尾，通过动态光散射测量证实了NPs的形成，其流体动力半径为40 - 66 nm。使用2 '，7 ' -二氯二氢荧光素(DCFH-DA)作为广谱ROS指示剂，评估ps的光诱导ROS生成能力。在635 nm激光照射下，聚集的ps表现出快速的ROS生成，二氯荧光素(DCF, DCFH-DA的氧化形式)的荧光信号增强。DCF的荧光强度在30 s内达到饱和，DTNI、DTNPI和DTNTI的荧光强度分别增强426倍、414倍和380倍，超过参考物ps结晶紫(CV, I型参考物，84倍)和氯e6 (Ce6, II型参考物，193倍)。为了明确产生的特定ROS种类，使用探针，如二氢霍达明123 (DHR123，用于O2·−))、羟基荧光素(HPF，用于·OH)和9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA，用于1O2))。照射180 s后，DHR123荧光显示大量O2·−产生，DTNI、DTNPI和DTNTI的荧光增强78倍、123倍和141倍，而CV的荧光增强41倍。600 s照射后的后续HPF检测显示，相应的ps (DTNI、DTNPI和DTNTI)的排放增量为741-、546-和373倍，CV的排放增量为327倍。平行ABDA降解实验证实了有效的1O2生成，计算的1O2量子产率为0.168 (DTNI); 0.127 (DTNPI)和0.175 (DTNTI)，高于商用吲哚菁绿(ICG, 0.002)，并通过单线态氧传感器绿(SOSG)进一步验证，在照射下具有特征性荧光增强。电子顺磁共振(EPR)谱与各自的自旋捕获剂为O2·−，·OH和1O2.的生成提供了补充证据31以DTNI为例，激光照射后，在甲醇和PBS体系中观察到5,5-二甲基-1-吡啶n -氧化物(DMPO)- O2·−和DMPO-·OH加合物对应的六线(g值为2.0060)和四线(g值为2.0057)EPR信号。三线EPR信号(g值为2.0073)进一步证实了2,2,6,6-四甲基哌啶(TEMP)-的存在1O2加合物。在没有ps或激光照射的对照实验中没有出现EPR信号，共同验证了这些NIR-II ps的I型和II型双重ROS生成能力。在635 nm激光照射下，ps的光热性能表现为温度的快速升高; 在20分钟内实现39.7°C (DTNI)、33.5°C (DTNPI)和41.3°C (DTNTI)的最大温度升高(ΔT)。DTNI与浓度和激光功率相关的热响应显示出精确的光热可控性。值得注意的是，DTNI通过6次加热-冷却循环保持稳定的光热性能，优于ICG的性能。计算出DTNI、DTNPI和DTNTI的光热转换效率(η)分别为39%、26%和52%。
线粒体靶向评价
我们首先评估了发展的ps的细胞毒性。不同ps处理后，MCF-7细胞出现不同的细胞毒性谱。DTNI表现出强烈的剂量依赖性细胞毒性，IC值为3.27 μM，而DTNTI (IC50= 19.9 μM)和DTNPI (IC50= 264.7 μM)的类似物的细胞毒性显著降低。相比之下，CHO细胞的细胞毒性较低，IC50值为14.15 μM (DTNI)， 134.2 μM (DTNTI)和341.2 μM (DTNPI)，突出了DTNI对癌细胞的潜在化疗活性。然后评估DTNI的亚细胞成像性能。在10 μM ps作用30分钟后，CLSM在MCF-7细胞中显示出明显的细胞质荧光。通过DTNI共定位实验证实了线粒体特异性MTG，显示出精确的定位能力，皮尔逊相关系数(PCC)为0.99。综合实验成功地排除了DTNI在其他细胞器中的存在，包括溶酶体、内质网、脂滴或细胞核。DTNPI和DTNTI类似物也显示出类似的线粒体靶向效率。无洗涤条件下的实时成像研究显示DTNI的线粒体定位迅速，5分钟内出现可检测的荧光信号，30分钟孵育后达到最佳图像分辨率。这种无水洗方案可以长期监测天然生理状态下的线粒体动力学。流式细胞分析证实成像条件下信号饱和，表明线粒体DTNI有效积累。此外，DTNI表现出出色的长期线粒体定位稳定性，即使在孵育5小时后，MTG仍保持较高的PCC(0.87)。DTNI对线粒体膜电位(MMP)改变的敏感性采用氧化磷酸化解耦剂羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)进行定量评估。剂量依赖性荧光衰减(200 μM CCCP下21.5%残留信号)表明DTNI对MMP波动的敏感性。值得注意的是，DTNI具有良好的光稳定性，在连续300 s激光照射后信号损失<20%。考虑到恶性细胞的超极化MMP特性(>60 mV)，我们假设DTNI脂质化结构会优先通过增强的静电相互作用与癌症线粒体相互作用在多个细胞系(HeLa、A549、U-87 MG、HCT116、CT26、4T1与CHO、3T3-L1)之间的比较分析显示，差异有显著性恶性细胞的荧光强度明显高于正常细胞。流式细胞术定量证实了这种癌症特异性靶向，其机制归因于恶性肿瘤中线粒体内膜摄取增强。为了验证DTNI在复杂生物学场景中的适用性，我们进行了混合细胞染色实验。选择稳定表达GFP的U-87 mg - fcl - gfp细胞作为指示细胞，MCF-7细胞作为癌细胞，CHO细胞作为正常细胞。DTNI在恶性细胞中表现出强烈的荧光信号，而在正常细胞中表现出微弱的背景。在其他细胞混合物(MCF-7/CHO和4T1/CHO)中也观察到这种癌细胞区分。进一步实验表明，DTNI在MCF-7细胞中的检测下限(0.59 nM)远低于CHO细胞中的检测下限(20.29 nM)。随后对多种癌细胞系的评估表明，DTNI对癌细胞(MCF、HeLa、A549、U-87 MG、HCT116、CT26和4T1细胞)的细胞毒性优于正常细胞(CHO和3T3-L1细胞)。更重要的是，这种癌症特异性毒性在缺氧条件下持续存在。这些发现证实了DTNI是一种精确的线粒体靶向探针，具有固有的癌细胞选择性，将其定位为肿瘤治疗应用的理想工具。
DTNI介导的光疗
鉴于DTNI具有光敏能力，我们评估了其光激活的细胞内ROS生成。635 nm照射下dni处理的MCF-7细胞CLSM分析显示DCF荧光强度随时间增加。流式细胞术定量证实了这些结果，显示在180 s光照后，近99%的细胞ROS阳性。使用MitoSOX检测线粒体ROS证实了mtROS的大量积累。在常氧和低氧条件下的比较评估显示出不同的ROS生成谱。dni染色的MCF-7细胞在635 nm激光照射下，荧光增强6.5倍(常氧)和5.3倍(缺氧)，双氢乙二胺(DHE)的红色荧光强烈。在相同条件下，hpf处理组观察到类似的dni触发荧光增强。SOSG实验显示出缺氧依赖性的1O2生成抑制(6.1倍vs 1.7倍)。这种I型ROS生成机制使DTNI在缺氧TME下具有特殊优势。使用JC-1和罗丹明123 (Rh123)探针进一步验证，dtni介导的光疗明显破坏了MMP, JC-1的荧光从红色转变为绿色，Rh123的荧光减少。光敏DTNI产生的强效mtROS促使我们评估其协同抗癌功效。635 nm激光照射dni处理的细胞后，观察到IC50值为2.07 μM (MCF-7)的强癌细胞抑制作用，表明化疗和光疗协同增强了癌细胞消融。此外，DTNI对正常CHO细胞的细胞毒性显著降低，在相同的照射条件下，IC50值为10.14 μM，表明其对癌细胞具有优先的光毒性。使用细胞死亡抑制剂的机制研究揭示了多种PCD途径的激活。铁下垂(fer1)、坏死性下垂(Nec-1)和凋亡(z-VAD-fmk)抑制剂显著降低细胞毒性，而自噬(3-MA)和焦下垂(VX-765)抑制剂的作用最小。ROS清除剂n -乙酰半胱氨酸部分减轻细胞毒性。激光照射放大了多种PCD通路的激活。这些结果共同表明，dtni介导的的联合治疗促进了铁下垂、坏死下垂和细胞凋亡的协同作用。
体内NIR-II FLI/ pti引导的协同治疗
为了提高生物利用度，我们使用DSPE-mPEG2000-Biotin共聚物通过溶剂-超声波纳米沉淀法制备了DTNI NPs的包封效率为61.2%，负载能力为19.1%。DTNI NPs具有与聚集体相似的吸收/发射特性，具有线性浓度依赖的荧光信号。这些球形NPs具有优异的水分散性(70.9 nm水动力直径，−5.4 mV zeta电位，保持7天的胶体稳定性，并在10分钟激光照射下表现出优异的光稳定性。光动力学评价显示，DTNI NPs通过I型和II型光化学过程产生稳健的ROS，其1O2量子产率为13.2%。光热分析显示，DTNI NPs在激光照射下表现出热疗(η = 45%)，在6个加热/冷却循环中表现出优异的热稳定性。DTNI NPs表现出动态的亚细胞运输，在0.5 h时显示溶酶体积聚(PCC = 0.85)，然后在6 h时迁移到线粒体(PCC = 0.91)。随后的分析显示，能量依赖性内吞作用是主要的摄取机制。显著的光诱导ROS生成使DTNI NPs在癌细胞中表现出强大的激光增强细胞毒性。值得注意的是，4T1细胞的IC50值从无激光时的1.94 μM下降到有激光时的0.73 μM。然而，较低的观察CHO细胞的细胞毒性，在相同条件下，IC50值从19.02 μM(无激光)变化到10.34 μM(有激光)。进一步评估DTNI NPs的体内NIR-II FLI和PTI性能。在相同条件下，DTNI NPs比ICG的组织穿透深度更大，在8 mm厚的鸡胸组织切片上仍然可以检测到NIR-II荧光。将DTNI NPs静脉注入原位4T1三阴性乳腺肿瘤小鼠3小时后，观察到肿瘤部位发出明亮的NIR-II荧光(>1000 nm)，邻近正常组织的干扰可以忽略不计。注射后36 h，肿瘤区域的NIR-II荧光信号达到峰值，肿瘤与肌肉之比为2.64，超过2.00.48的诊断阈值。而生理盐水组的荧光信号可忽略不计。与离体荧光成像结果一致。DTNI NPs的长期肿瘤积累确保了体内良好的PTI性能。激光照射后肿瘤温度从35.9℃升高到56.8℃(ΔT = 20.9℃)。值得注意的是，快速热疗诱导(δT = 14.4°C, 2分钟内)保证了肿瘤靶向PTT的应用。基于精确的肿瘤靶向结果，我们进行了全面的抗肿瘤评价，随访12天。将原位4T1乳腺荷瘤小鼠随机分为生理盐水、生理盐水加激光、DTNI NPs、DTNI NPs加激光(冷却)和DTNI NPs加激光五组。与对照组(生理盐水组和生理盐水加激光组)相比，DTNI NPs和DTNI NPs加激光(冷却)组肿瘤生长受到抑制，表明CT和CT/PDT治疗的有效性。值得注意的是，由于CT/PDT/PTT的协同作用，激光组DTNI NPs的肿瘤完全根除。值得注意的是，在整个治疗期间，单剂量激光照射足以消融肿瘤，没有明显的体重波动，这证明了精确的治疗效果。治疗后采集主要脏器和肿瘤组织，采用H&E、Ki67、TUNEL染色法进行组织病理学分析。结果显示，在CT (DTNI NPs)或CT/PDT(冷却下激光照射的DTNI NPs)条件下，细胞出现明显的凋亡和坏死形态，并伴有明显的细胞增殖抑制。当CT和PDT/PTT联合激活(激光DTNI NPs)时，广泛的肿瘤凋亡、坏死和增殖抑制被放大。对照组(盐水组或激光盐水组)未观察到明显的癌细胞损伤。
结论
我们开发了一种线粒体靶向NIR-II光敏剂(DTNI)，通过协同化学和光治疗机制激活三元PCD。优化后的D -π-A共轭结构使DTNI具有聚集诱导的NIR-II发射特性。通过扭曲分子构象控制激发态能量耗散，实现了激光照射下I型和II型ROS的生成和光热转换。选择性的线粒体DTNI积累促进了化疗对细胞呼吸链的破坏，导致线粒体功能障碍。光疗激活通过增强ROS风暴放大线粒体疾病，触发并发铁下垂、坏死性下垂和凋亡信号通路。协同化疗和光疗引起的多个PCD网络引发了强大的ICD，使局部肿瘤消融与长期的全身免疫激活成为可能。DTNI NPs通过NIR-II FLI/ pti引导的多模式治疗实现了原位三阴性乳腺肿瘤的精确根除。
参考文献
Near-Infrared-II Aggregation-Induced Emission Photosensitizers with Mitochondrial Respiration Perturbation Activity Amplifies Ferroptosis Necroptosis and Apoptosis for Cancer Immunotherapy，Quan Pan, Jiabao Zhuang, Lijin Yang, Lantian Huo, Nan Li*, Na Zhao*，Ben Zhong Tang，CCS Chem. 2025, https://doi.org/10.31635/ccschem.025.202505952
