内容提要
缺氧是肝细胞癌(HCC)的一个显著特征，它会破坏治疗效果，增加复发率，并促进转移，尤其是在临床环境中的光动力治疗(PDT)期间。研究表明，缓解肿瘤缺氧可提高PDT疗效。然而，持续存在的挑战，包括不理想的氧气输送效率和缺乏PDT期间血氧波动的实时反馈，极大地阻碍了肿瘤治疗的疗效。本研究利用近红外二区 (NIR-II)光声(PA)成像技术解决了这些问题，用于肿瘤靶向氧输送和控制释放。为此，开发了一种名为BLICP@O2的仿生氧输送系统，该系统利用肿瘤细胞膜和热敏脂质体作为氧载体，含有NIR-II染料IR1048，光敏剂Ce6和全氟己烷。在1064和690 nm的连续辐照下，BLICP@O2表现出明显的光热和光动力效应。光热加热触发氧气释放，增强Ce6的光动力效果。PDT期间血氧的变化由多光谱PA成像跟踪，并通过缺氧缓解介导的PDT疗效增强。
实验结果与讨论
BLICP@O2的制备与表征
首先，用硅包覆NIR-II小分子染料IR1048，得到水溶性IR1048。然后，采用薄膜蒸发法将光敏剂Ce6和Si@IR1048装入热敏脂质体中，得到Lipo@IR1048/Ce6的混合物。收集Huh7肿瘤细胞膜，通过连续挤压与Lipo@IR1048/Ce6融合，得到均匀的仿生IR1048/Ce6负载脂质体(BLIC)。将全氟己烷(PFH)加入到BLIC中，在冰浴超声下将其加载到载体中，然后将O2引入溶液中，得到BLICP@O2。透射电镜(TEM)图像显示BLICP@O2呈均匀球形，直径约为120nm。接下来，观察颗粒大小随时间的变化，以评估BLICP@O2的稳定性。结果表明，BLICP@O2在3d内保持稳定，尺寸的增加可以忽略不计。在zeta电位方面，膜包覆纳米粒子的表面电荷为≈−18.5 mV，而LICP@O2的表面电荷为≈−3.06 mV。通过分析BLICP@O2的载药量，Ce6的包封效率(EE)为72.1%，载药效率(DL)为10.01%，而IR1048的包封效率(EE)为59.23%，载药效率(DL)为8.23%( Supporting Information)。BLICP@O2的荧光光谱和吸光度光谱分别显示Ce6和IR1048的强烈特征峰，表明Ce6和IR1048加载成功( Supporting Information)。此外，通过对diolab标记的细胞膜和ce6标记的脂质体进行成像，直接观察到BLICP@O2中脂质体与肿瘤细胞膜的成功融合。为了进一步验证BLICP@O2与癌细胞粘附分子的成功功能化，我们评估了BLICP@O2表面的蛋白质组成。临床样品的免疫荧光染色显示，CD47在肝癌细胞中高表达，CD47是一种使肿瘤细胞逃避免疫系统攻击的“不要吃我”信号分子。蛋白凝胶电泳显示，BLICP的蛋白谱与Huh7细胞膜的蛋白谱相似。此外，Western blot分析证实了CD47和特异性同源结合黏附分子上皮细胞黏附分子(EpCAM)在BLICP上的存在，分别使细胞从巨噬细胞中逃逸和同源靶向肿瘤。
NIR-II光声特性和光热触发氧释放
BLICP@O2表现出明显的剂量依赖性温度升高，在1064 nm激光，1 W cm−2,0.5 mg mL−1照射5分钟后，温度可达到56.8℃。计算得出BLICP@O2光热转换效率为57.16%。基于良好的光热效果，使用定制的PA成像系统评估NIR-II PA性能。BLICP@O2在1064 nm处表现出较强的NIR-II PA信号，PA强度与BLICP@O2在水中(pH = 7.4)的浓度呈线性相关。在2000个1064 nm的激光脉冲下，PA信号没有发生明显变化，这表明BLICP@O2具有良好的稳定性。正如预期的那样，使用BLICP@O2进行NIR-II PA成像可以获得更深层次的生物组织成像能力。BLICP@O2浓度增加导致荧光强度呈线性增加，由于PFH具有优异的氧溶解度和在适当温度下从液态变为气态的能力，因此被广泛用作氧载体。我们使用超声造影(CEUS)成像来评估氧气释放，结果表明，体积比为4%时产生的氧气最有效。然后对BLICP@O2的载氧能力进行量化，得出的值为≈2.0667±0.5201 mg g−1。此外，在加热和1064 nm激光热触发下，BLICP@O2都表现出有效的氧气释放。与BLICP相比，BLICP@O2在加热条件下(50℃)，在1分钟内将溶解氧浓度从3迅速提高到≈8 mg L−1。这些结果表明，BLICP@O2在热触发下产生含氧气泡，这可能是由于PFH负载具有显著的载氧能力，以及热敏脂质体因热破裂而加速氧气释放。BLICP@O2的单重态氧量子产率为0.56，表明其具有显著的光动力潜力。通过测定1,3二苯基异苯并呋喃(DPBF)的吸光度，进一步检测BLICP@O2产生1O2的情况。与BLICP相比，经过690 nm激光照射后，BLICP@O2溶液中DPBF的吸光度强度明显降低，说明BLICP@O2提供了更多的氧气，因此光动力学效应增强。此外，随着690 nm照射时间的增加，BLICP@O2表现出随时间变化的光动力效应。这些结果表明BLICP@O2不仅可以作为PA造影剂，还可以作为光热可控供氧的纳米平台来增强光动力效果。
BLICP@O2体外特异性评价
BLICP@O2包含一种HCC细胞膜，我们假设它具有HCC细胞的功能，并且具有显著的免疫逃避和同源靶向能力。为了确定BLICP@O2是否具有这些特性，我们使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)对RAW264.7巨噬细胞对BLICP@O2的摄取进行了初步评估，以评估其抗吞噬作用。与RAW264.7巨噬细胞孵育4小时后，BLICP@O2在巨噬细胞中Ce6荧光信号弱于LICP@O2，说明BLICP@O2具有较强的免疫逃避能力，因此被巨噬细胞摄取较少。另一方面，BLICP@O2与各种正常细胞和肿瘤细胞，包括Huh7肝癌细胞、非肿瘤细胞(如LO2肝细胞)和其他肿瘤细胞(如HepG2肝癌细胞、LM3肝癌细胞、PANO2胰腺癌细胞)孵育4小时，有趣的是，与其他细胞相比，只有Huh7细胞能显著地占BLICP@O2。这一结果可能是由于BLICP@O2上的细胞粘附分子EpCAM特异性地识别同源细胞上的粘附分子，然后与细胞结合。这些发现表明BLICP@O2既能避免免疫细胞的吞噬，又能靶向Huh7细胞，具有良好的Huh7肿瘤特异性。
体外增强肿瘤PDT BLICP@O2
BLICP@O2通过双波长激发级联治疗策略在体外治疗HCC。为了模拟肿瘤微环境，将Huh7细胞暴露在低氧条件下(1%)。首先，分别评价PDT和光热疗法(PTT)的治疗效果。Huh7细胞与不同浓度的BLICP@O2共孵育，并接受仅使用1064或690 nm激光照射的PTT或PDT治疗。随着BLICP@O2浓度的增加，细胞活力逐渐降低。接下来，通过使用不同的辐照方法处理LICP@O2和BLICP@O2共孵育的细胞，验证PDT和PTT的协同效应。在单激光照射组(690或1064 nm)中，BLICP@O2通过PDT或PTT杀死约50%的细胞，但由于其对肿瘤细胞膜的靶向作用增强，仍比LICP@O2具有相当大的优势。当仅用690或1064 nm激光照射时，BLICP@O2-treated细胞的活力下降，主要是由于PTT或PDT效应。先用1064 nm照射，再用690 nm激光(1064/690 nm)照射，BLICP@O2-treated细胞的细胞活力下降到≈10%。通过钙黄素- am /碘化吡啶(PI)的活/死双染色试验进一步验证了结果。流式细胞术检测细胞死亡类型。双波长级联治疗策略(1064/690 nm组)诱导肿瘤细胞凋亡(凋亡率60%)。这些结果表明，双波长程序化级联处理策略可以通过热触发机制协同控制氧的释放和供应，从而提高PDT的疗效。
此外，我们还评估了双波长程序化级联治疗策略对肿瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用。体外划痕实验表明，BLICP@O2+1064 nm处理的Huh7细胞在缺氧环境中培养12小时后，划痕面积明显大于PBS组，表明运动受到很大限制。通过跨井迁移实验来评估双波长程序化级联处理策略对Huh7细胞迁移能力的影响。1064/690 nm处理的细胞迁移能力受到很大限制，与PBS组相比，迁移细胞数量减少了70%以上。随后在基质凝胶中的侵袭实验也证实，1064/690 nm处理大大抑制了Huh7细胞的侵袭，与PBS组相比，通过基质凝胶的细胞数量减少了约97%。基于这些积极的结果，BLICP@O2的双波长程序化级联治疗策略在治疗缺氧肿瘤细胞方面显示出显著的优势。
BLICP@O2的体内特异性评价
LICP@O2通过增强纳米颗粒的渗透性和滞留(EPR)效应，在体内表现出较长的滞留时间;然而，在3 h时观察到最小的肿瘤积聚，9 h时未检测到明显的信号。相反，BLICP@O2采用了通过EPR效应的被动靶向和通过癌细胞膜包被的主动同源靶向，导致注射后6 h有明显的荧光信号表明肿瘤积聚。注射后24 h采集肿瘤及主要脏器进一步分析LICP@O2和BLICP@O2的分布。BLICP@O2的癌细胞膜涂层表现出同源肿瘤靶向能力，导致肿瘤蓄积比LICP@O2增加2.1倍。
采用PA成像检测体内深部信息BLICP@O2。给药LICP@O2或BLICP@O2后，使用定制的PA系统监测肿瘤内的NIR-II (1064 nm) PA信号。注射LICP@O2的小鼠在1064 nm激光照射下几乎没有PA信号，而BLICP@O2-injected小鼠则呈现先上升后下降的趋势。静脉注射后6小时PA信号最强，说明此时BLICP@O2在肿瘤内的积累达到峰值。体内成像结果显示BLICP@O2具有同源靶向能力，可指导体内肿瘤治疗。
体内增强肿瘤PDT BLICP@O2
受体外细胞实验结果的鼓舞，我们进一步研究了体内程序化级联疗法。首先，在静脉注射探针后6 h时间点，BLICP@O2组在1064 nm激光照射下，5 min内肿瘤温度升高至51.8℃。相比之下，对照组在肿瘤部位表现出轻微的温度波动(44.6℃)。采用PA显像监测肿瘤血氧饱和度。值得注意的是，在静脉注射BLICP@O2后间隔6小时，小鼠接受1064 nm激光照射，导致肿瘤血氧饱和度显著升高，这表明热触发的可控氧释放从BLICP@O2有效。25只荷瘤小鼠随机分为PBS、BLICP@O2、BLICP@O2+Laser690nm、BLICP@O2+Laser1064nm和BLICP@O2+Laser1064/690 nm 5组。BLICP@O2+Laser1064/690 nm组的肿瘤大小和重量较其他组明显减小，这可以从小鼠的图片中看出，说明BLICP@O2具有良好的治疗效果。在整个治疗期间，小鼠体重保持稳定，几乎没有观察到副作用。
此外，采用苏木精和伊红染色(H&E)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dutp -生物素缺口末端标记(TUNEL)染色进行病理分析，观察治疗效果。在程序级联治疗组中，观察到严重的损伤和高水平的肿瘤细胞凋亡，而在其他对照组中检测到可忽略或最小的损伤。免疫荧光法检测肿瘤HIF-1 - rfs，评价肿瘤缺氧情况。PBS组表现出明显的肿瘤缺氧，而690 nm激光治疗导致缺氧缓解有限，可能是由于PDT的细胞毒性作用。在程序级联治疗组中，HIF-1的表达被有效抑制，几乎没有检测到缺氧信号。这些结果进一步阐明了NIR-II光介导的双波长程序化级联治疗策略在体内显著增强PDT疗效。
总结
本研究采用NIR-II PA成像引导和双波长程序化级联治疗策略，实现了准确的氧输送和控释，提高了PDT治疗HCC的疗效。基于肿瘤缺氧的临床挑战，我们成功合成了一种新型的NIRII光热可控供氧仿生纳米颗粒(BLICP@O2)。在高缺氧HCC背景下，PA成像引导BLICP@O2通过精准可控的氧气释放有效缓解肿瘤缺氧，显示出显著的PDT疗效。肿瘤细胞膜的仿生修饰使HCC治疗的精确同源靶向递送成为可能。NIR-II PA成像引导下BLICP@O2治疗效果显著，可以是因为双激光(1064/690 nm)触发氧气的可控快速释放，通过改善缺氧HCC微环境提高PDT疗效，以及PA成像引导下的无创监测，实时动态评估肿瘤氧水平。
参考文献
NIR-II Photoacoustic Imaging-Guided Oxygen Delivery and Controlled Release Improves Photodynamic Therapy for Hepatocellular Carcinoma, Silue Zeng, Jingqin Chen,* Rongkang Gao, Rui Chen, Qiang Xue, Yaguang Ren, Liangjian Liu, Chuanyu Tang, Haoyu Hu, Ning Zeng, Sai Wen, Hai Zhang, Chengbo Liu,* and Chihua Fang*, Adv. Mater. 2024, 36, 2308780,
https://doi.org/10.1002/adma.202308780
